3.细胞工程课件

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3.细胞工程本章学习目的：学习植物组织培养、原生质体的制备和培养的原理和基本方法；掌握植物单倍体植株的概念和在生产实践中的意义；了解植物代谢产物的概况和影响其工业化生产的主要因素；认识动物细胞融合的基本方法及其在单克隆抗体制备中的应用；了解哺乳动物体细胞克隆的基本方法以及诱导多功能干细胞的重要意义；了解CAR-T技术的基本概念和治疗癌症的原理；学习CRISPR的基本原理及其实际应用方法。3.1植物细胞工程3.1.1

植物组织培养

以植物细胞具有全能性为基础发展起来的一项无性繁殖新技术。----先从植物体分离出离体的器官、组织、或细胞；----在无菌条件下接种在含有各种营养物质及植物激素的培养基上；----诱导出脱分化的愈伤组织，在此基础上再进行诱导分化，生成芽和根，

形成完整的植株；----移植到土壤中进行大规模培养；

优点：----打破植物生长的季节限制；----可获得大量无毒苗，提高经济作物的品质和产量；3.1.1.1预备阶段

选择合适的外植体根、茎、叶都可无菌操作除去病原菌及杂菌

配制适宜的培养基基本成分，如蔗糖或葡萄糖，以及氮、磷、钾、镁等微量无机物，如铁、锰、硼酸微量有机物，如吲哚乙酸、激动素、肌醇等

配制适宜的培养基基本成分，如蔗糖或葡萄糖，以及氮、磷、钾、镁等微量无机物，如铁、锰、硼酸微量有机物，如吲哚乙酸、激动素、肌醇等

配制适宜的培养基基本成分，如蔗糖或葡萄糖，以及氮、磷、钾、镁等微量无机物，如铁、锰、硼酸微量有机物，如吲哚乙酸、激动素、肌醇等3.1.1.2诱导去分化阶段

培养基中一般应添加较高浓度的生长素类激素愈伤组织培养愈伤组织切割成数块后移植，继续培养3.1.1.3继代增殖阶段3.1.1.4生根发芽阶段

将愈伤组织移置于含适量细胞分裂素，没有或仅有少量生长

素的分化培养基中。诱导根生长3.1.1.5移栽成活阶段移栽3.1.2.

植物细胞原生质体的制备与融合

原生质体（protoplast）：就是脱去全部细

胞壁的植物细胞。---方便地进行有关遗传操作---具有全能性，能发育成完整植株---细胞无性系变异和突变体筛选的重要来源---诱导融合形成杂种细胞3.1.2.1原生质体的制备

取材与除菌

：-----取材：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、

悬浮培养细胞和嫩叶。-----除菌：清水洗2～3次,然后浸入70%酒精消毒后,再放进3%次氯酸钠处理。

酶解：纤维素酶、纤维素二糖酶以及果胶酶原生质体3.1.2.2原生质体的融合

化学法诱导融合----聚乙二醇(PEG)结合高钙、高pH诱导融合

物理法诱导融合----微电极法诱导细胞融合原生质体融合电融合仪3.1.2.3杂合体的鉴别与筛选

杂合细胞的显微镜鉴别----形态、颜色遗传互补法筛选杂合细胞----遗传互补法采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体----染色体核型分析、染色体显带分析、同功酶、核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性等根据再生植株的形态特征进行鉴别3.1.3.单倍体育种--------是指细胞中仅含一组染色体的个体单倍体植株特点：

叶小、株矮，生活力弱，且高度不育

不受显性等位基因的掩盖与遮蔽效应影响，易于挑选出具

有可用性状的隐性突变体后代不会产生分离，因而遗传性是稳定单倍体二倍体三倍体四倍体单倍体植株培育途径：孤雌繁殖途径------植物卵细胞不经受精而发育成单倍体胚，继而长成单倍体植株。孤雄繁殖途径-----精子进入胚囊后不与卵细胞受精而独自发育成单倍体胚，再发育成株。卵细胞退化消失。无融合生殖-----助细胞或反足细胞也与受精卵形成的二倍体胚同步发育成单倍体胚，形成双胚或多胚种子。3.1.3.1花药培养

选取成熟度适中的花蕾或幼穗

选择适当的培养基与培养条件缺点：双倍体植株所占百分比过高3.1.3.2花粉培养

自然散开法-----将花蕾或幼穗在7℃冷处理二周后,让其在适当的液体培养基表面培养，待花药自然开裂散落出花粉后，离心收集花粉，置于培养基中生长缺点：白化苗出现过多3.1.3.3单倍体培养物的加倍

在诱发单倍体植株的各阶段(形成愈伤组织、幼胚及小苗)，都可用秋水仙素处理，使染色体加倍，然后按常规途径培养，即可能得到染色体加倍的能正常开花、结果的二倍体植株。秋水仙素处理后，染色体加倍3.1.4．植物细胞代谢工程----------指利用转基因技术,对细胞中的代谢反应、代谢物的转运过程进行调节,以提高细胞生产相应次生代谢物的能力。3.1.4.1植物细胞的代谢产物

初级代谢产物(Primarymetabolites)--------指植物细胞的代谢活动所生成的对自身生长和繁殖所必

需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。

次生代谢产物(Secondarymetabolites)--------由植物初级代谢产物衍生而来的一类小分子有机化合物，

它们不是有机体生长必不可少的物质，主要是帮助植物

适应周围环境。--------分为七大类，包括苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、类萜、甾体及其甙、生物碱等

红豆杉与紫杉醇的结构-----紫杉醇又称为紫杉烷二萜，是从红豆杉属的紫杉树皮中得到的二萜类次生代谢产物，能有效地抑制肿瘤细胞的有丝分裂，被广泛应用于治疗卵巢癌，乳腺癌和肺癌等。红豆杉紫杉醇结构3.1.4.2影响植物细胞生成次生代谢产物的因素培养细胞的分化程度培养细胞的不稳定性细胞培养液中次生代谢产物的积累培养过程中植物细胞聚集成团培养细胞时会采取以下措施：

添加茉莉酸（Jasmonates）

即时清除培养基中所积累的次生代谢产物。

细胞固定化培养。

改进次生代谢产物的代谢途径

紫杉醇的合成途径由异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基二磷酸（DMAPP）在双牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合成酶的催化下形成GGPP，然后经过19种酶的催化，最终形成紫杉醇。3.1.4.3植物代谢产物的工业化生产

悬浮培养系统半连续培养方法：即每隔一定时间(如1～2天)收获部分培养物，再加入等量培养基的方法连续培养方法：即培养若干天后在连续收获细胞的同时不断补充培养液的方法封闭式植物细胞培养系统

固定化细胞培养系统

平床培养系统:本系统由培养床、贮液罐和蠕动泵等构成，设备较简单，比悬浮培养体系能更有效地合成次生代谢物。

立柱培养系统:将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合,制成多个1～2cm3的细胞团块,放置于无菌立柱中。植物细胞立柱培养系统3.2动物细胞工程3.2.1

细胞、组织培养

细胞培养指的是离体细胞在无菌培养条件下的分裂、生长，在整个培养过程中细胞不出现分化，不再形成组织。

组织培养意味着取自动物体的某类组织，在体外培养时细胞一直保持原本已分化的特性，该组织的结构和功能持续无发生明显变化。培养中的成纤维细胞培养中的组织细胞3.2.1.1细胞培养法

培养动物细胞步骤（无菌条件下）：

分离组织，以培养液漂洗干净

用无菌刀切成小组织块组织块用解离液（含蛋白酶类）离散细胞离心收集细胞后，将目的细胞吸移至培养瓶培养

微导管培养法-------外径不超过1mm的微导管（硝酸纤维素或醋酸纤维素构成）浸没于培养基中。动物细胞贴附生长于微管床表面。

微载体培养法------微载体（葡萄糖聚合物制成）与培养基混合均匀，动物细胞则贴附在微载体表面旺盛地生长。

微胶囊培养法

-----细胞与褐藻酸钠混合后，滴加CaCl2，褐藻酸钠硬化成半透性微胶囊，细胞在微胶囊内生长。微载体培养法3.2.1.2组织培养法

分离组织，用培养液漂洗；用无菌刀将该组织分切成1～2mm3小块，移入培养瓶；

加入合适的培养基静置37℃培养。组织接种3.2.1.3培养物的传代

物理法：用培养液冲洗后，用刮刀剥离培养组织，视组织块大小进行适当切割后再漂洗、移置于新培养瓶中。

酶解法(0.25%胰酶)：用酶降解组织细胞，细胞悬浮后，分盘培养于新培养瓶中。细胞传代3.2.1.4无血清培养

无血清培养基：

基础培养基,DME培养基与Ham/F12培养基1:1混合

基质因子,包括纤黏素、血清铺展因子、胎球蛋白、胶原和多聚赖氨酸等

生长因子、激素和维生素等约30种有机和无机微量物质,其中包括哺乳动物的绝大多数内分泌激素。无血清培养添加剂3.2.1.5培养物的长期保存

经典传代法：使培养物始终处于活跃生长状态

冷冻保存法：

细胞与5%～10%的甘油或二甲亚砜混匀，封装于若干个安瓿瓶中

缓慢降温(1～3℃/min)至-30℃

继续降温(15～30℃/min)至-150℃

转移至液氮冻存，可无限期保存细胞逐级降温3.2.1.6细胞组织培养污染的防治

一般性细菌污染无菌操作

培养基中添加氨苄青霉素及链霉素

支原体污染：Plasmocin细菌污染的细胞支原体污染的细胞3.2.2动物细胞融合3.2.2.1病毒诱导融合

弃上清

灭活仙台病毒悬液

↗

↓

双亲本细胞→分别制成细胞悬液→混合离心→双亲细胞沉淀

混匀

冰浴20min水浴37℃30min

细胞凝集

细胞融合→选择培养基培养

间歇摇动

间歇摇动

3.2.2.2化学诱导融合

聚乙二醇(PEG)：动植物细胞融合的主要手段pH:7.4～8.0分子量：1000～2000浓度：30%～40%3.2.2.3电激诱导融合

方法参见植物原生质体电激融合电融合仪PEG诱导细胞融合3.2.3单克隆抗体与杂交瘤技术多克隆抗体：多个B淋巴细胞都可以针对同一个抗原的不同抗原决定簇产生相应的抗体。单克隆抗体：一个B淋巴细胞生成的抗体。

从血液中分离单克隆抗体的障碍：

单克隆抗体的浓度太低，

不同的抗体结构类似，常规的分离方法很难区分；B淋巴细胞在体外不分裂，无法通过细胞培养的方式扩增B淋巴细胞。

杂交瘤技术：------将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合,获得了既能产生单一抗体又能在体外无限生长的杂合细胞（Kohler和Milstein，1975）3.2.3.1动物免疫皮下免疫：将抗原物质与佐剂（弗氏完全佐剂）混合后注射入动物皮下进行第一次加强免疫四周后三次加强免疫每隔三周冲击免疫三天前抗体效价的检测动物皮下注射抗原物质3.2.3.2杂交瘤细胞的制备和选择分离B淋巴细胞

将鼠骨髓瘤细胞和Ｂ淋巴细胞混合

融合细胞

杂交瘤细胞RPMI-1640培养基及血清继续培养增殖聚乙二醇(PEG取小鼠脾脏筛选扩增培养抗体效价测定（ELISA）筛选出的杂交瘤细胞3.2.4哺乳动物体细胞克隆

苏格兰PPL生物技术公司与罗斯林（Roslin）研究所---------维尔穆特(Wilmut)博士第一只体细胞克隆羊“多莉”（1996,6出生-2003,2死亡）即使是高度分化的哺乳动物体细胞核仍然具有遗传全能性体细胞核克隆动物热体细胞克隆牛（1998）：新西兰、日本、法国体细胞克隆小鼠（1998）：美国体细胞克隆骡子，马，狗，猪，猫克隆马克隆狗克隆猪克隆猫中国的体细胞克隆

山羊：西北农林科技大学（2000）体细胞克隆牛，水牛，黄羊，猪相继问世

大熊猫的克隆：陈大元，中国科学院动物研究所生殖

生物学国家重点实验室--------异种卵细胞质核移植：大熊猫的体细胞核移植入家兔卵细胞质。--------只能发育至囊胚阶段陈大元与异种克隆大熊猫体细胞克隆猴

第一只体细胞克隆猴中中和华华

五只BMAL1基因缺失的体细胞克隆猴

中国科学院神经科学研究所2017,112019,13.2.4.1多莉的克隆技术

第一个母亲第二个母亲第三个母亲(成功率只有0.36%)小鼠的克隆技术：檀香山技术

克隆羊多莉技术与檀香山技术对比3.2.4.2克隆羊多莉的意义与争议安全性：早衰，突变伦理道德：人的克隆《世界人类基因组与人权宣言》-------国际上第一个禁止克隆人的法律文件

中国对克隆人研究--------不赞成、不参与、不资助，也不接受外来科学家从事这方面研究。3.2.5细胞重新编程与诱导多功能干细胞德国生物学家魏斯曼(1892年):--------体细胞分化一旦发生，将不能回到其未分化状态(魏斯曼障碍)德国生物学家魏斯曼（1834-1914）克隆羊多莉的诞生:--------高度分化的体细胞可沿着当初分化的途径重新回到分化前的状态。3.2.5.1细胞重新编程

在体外利用“重新编程因子”将成熟体细胞的分化记忆去除，使已经关闭的，有关细胞分化的基因重新表达，诱导体细胞重新回到早期干细胞状态，在此基础上诱导形成各种类型的细胞，用于替换体内损坏的或者失去功能的细胞。3.2.5.2诱导多功能干细胞的发现日本学者山中伸弥：诱导多功能干细胞（Inducedpluripotentstemcells，iPS）------普通皮肤细胞重返干细胞的状态------荣获2012年诺贝尔生理学或医学奖山中伸弥------同时转入Oct4,Sox2,cMyc,和Klf4四个基因3.2.5.3诱导多功能干细胞的改进及应用存在的问题：诱导成功率低：0.01～0.1%基因变异诱发肿瘤改进方法小分子诱导：替代Oct4,Sox2,cMyc,和Klf4蛋白质诱导

再生医学：治疗脊髓损伤、帕金森病等疾病-------日本京都大学：iPS细胞诱导成神经细胞（2018,8）iPS细胞诱导成T细胞（2018,11)3.2.6免疫细胞工程----CAR-T技术CAR-T：ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法—利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞3.2.6.1.T细胞的种类细胞毒T细胞（cytotoxicTcell）辅助T细胞（helperTcell）调节/抑制T细胞（regulatory/suppressorTcell）记忆T细胞(memoryTcell)CAR-T技术就是要在细胞毒T细胞（cytotoxicTcell）表面插入嵌合抗原受体(CAR)，赋予细胞毒T细胞识别肿瘤抗原的能力。3.2.6.2.T细胞的激活抗原呈送细胞（Antigenpresentingcells，APC）双信号系统信号1：主要组织相容性复合体（MHC）+抗原短肽/

T细胞受体（TCR）信号2：B7/CD283.2.6.3CAR的结构第三代CAR蛋白的结构胞外段：信号肽抗体可变区：识别抗原跨膜段：CD28胞内段TCR结合蛋白Zeta的胞内段CD28胞内段4-1BB（CD137）胞内段3.2.6．4.肿瘤特异性抗原CAR-T细胞与肿瘤抗原的识别白血病：CD19抗原肺及前列腺癌：ERRB2（HER-2/neu）抗原肾细胞癌：CAIX抗原疗肺癌和卵巢癌等：LewisY抗原3.2.6.5.治疗流程T细胞分离：从白血病病人身上分离T细胞T细胞修饰：制备CAR-T细胞。扩增：体外培养，大量扩增CAR-T细胞回输：把扩增好的CAR-T细胞回输到病人体内。监控：预防细胞因子释放综合症（Cytokinereleasesyndrome）时间：3个星期左右，其中细胞“提取-修饰-扩增”需要约2个星期。3.2.7动物细胞制药工程—重组蛋白质制品原核细胞

细菌：缺少翻译后修饰真核细胞：糖基化，折叠，酶切，二硫键

酵母细胞

昆虫细胞

哺乳细胞

3.2.7.1生产药物的主要动物工程细胞

中国仓鼠卵巢细胞(CHO):生物制药领域内的主力军。

具有和人体细胞相似的翻译后修饰；

监管机构的认可；

较少的内源分泌性蛋白；

在无血清及限定培养基中可快速稳健地悬浮生长；

无病毒感染后所带来的安全性问题;

几十年来积累的知识和经验。

目前60%以上的生物药品是由这种细胞生产出来的

仓鼠肾脏(BHK)细胞：常用来生产抗血友病的产品诺其（NovoSeven）凝血因子Ⅷ（Kogenate）。

小鼠骨髓瘤细胞（NS0或SP2/0）：主要生产单克隆抗体类药物

治疗类风湿关节炎：类克（Remicade）

治疗结直肠癌：爱必妥（Erbitux）预防小儿呼吸道病毒感染：帕利珠单抗（Synagis）治疗红斑狼疮：贝利木单抗（Benlysta）

人成纤维肉瘤细胞HT1080：蛋白酶制品

治疗黏多糖贮积症：艾杜硫酶(Elaprase)

治疗脂肪积聚（法布里病）：Replagal

治疗I型戈谢病：Vpriv人胚胎肾细胞HEK293：生产治疗血友病和糖尿病的药物重组抗血友病因子：Eloctate、Alprolix降血糖药：Trulicity（度拉鲁肽）3.2.7.2工程细胞的改进

永生化目的基因的定点插入抗细胞凋亡细胞周期的阻滞分子伴侣（chaperone）的表达蛋白质分泌代谢产物蛋白质糖基化3.2.7.3工程细胞的大规模培养

无血清培养

悬浮培养

流加培养及灌注培养3.3基因编辑技术-CRISPR3.3.1CRISPR/Cas系统的研究历史1987年日本学者吉住石野

大肠杆菌中克隆碱性磷酸同工酶—NNNN—5个连续且高度同源的重复序列29bp32bp29bp2001年,西班牙学者FranciscoMojica和RuudJansen

命名为重复序列CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)，即“成簇的规律间隔短回文重复序列”2007年,美国学者RodolpheBarrangou

证实了CRISPR是一种适应性免疫系统2008年,Brouns和Vand