2.基因工程课件

2第二章基因工程本章学习目的：

学习基因工程基本原理和基本操作过程,为进一步学习生物技术相关知识和从事基因工程工作打下基础。

2.1基因工程概况

2.1.1基因工程的基本含义

按照人们的愿望（人为的），进行严密的设计（类似工程设计），通过体外DNA重组（非生命活动过程）和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短的时间内趋于完善（区别于自然突变和常规育种），创造出更符合人们需求的新的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。2.1.2基因工程的主要理论依据不同基因具有相同的遗传物质(DNA/RNA)基因是可以从DNA上切割下来的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的(绝少数除外)可以通过DNA复制把遗传信息传递给下一代

2.1基因工程概况

编码氨基酸的通用遗传密码子第一位（5′端）第二位（中间）第三位（3′端）UCAG

U苯丙氨酸Phe丝氨酸Ser酪氨酸Tyr半胱氨酸CysU苯丙氨酸Phe丝氨酸Ser酪氨酸Tyr半胱氨酸CysC亮氨酸Leu丝氨酸Ser终止stop终止stopA亮氨酸Leu丝氨酸Ser终止stop色氨酸TrpG

C亮氨酸Leu脯氨酸Pro组氨酸His精氨酸ArgU亮氨酸Leu脯氨酸Pro组氨酸His精氨酸ArgC亮氨酸Leu脯氨酸Pro谷氨酰胺Gln精氨酸ArgA亮氨酸Leu脯氨酸Pro谷氨酰胺Gln精氨酸ArgG

A异亮氨酸Ile苏氨酸Thr天冬酰胺Asn丝氨酸SerU异亮氨酸Ile苏氨酸Thr天冬酰胺Asn丝氨酸SerC异亮氨酸Ile苏氨酸Thr赖氨酸Lys精氨酸ArgA甲硫氨酸Met苏氨酸Thr赖氨酸Lys精氨酸ArgG

G缬氨酸Val丙氨酸Ala天冬氨酸Asp甘氨酸GlyU缬氨酸Val丙氨酸Ala天冬氨酸Asp甘氨酸GlyC缬氨酸Val丙氨酸Ala谷氨酸Glu甘氨酸GlyA缬氨酸Val丙氨酸Ala谷氨酸Glu甘氨酸GlyG

*

UGA在所有生物的线粒体中编码色氨酸；CUA在酵母线粒体中编码苏氨酸；AGA在果蝇中编码丝氨酸，在哺乳动物线粒体中编码终止子；AUA在哺乳动物、果蝇和酵母线粒体中编码蛋氨酸。2.1.3基因工程研究的基本技术路线

2.1基因工程概况

2.1.4基因工程突出的优点

打破了常规育种难以突破的物种之间的界限可以使原核生物与真核生物之间的遗传信息进行相互重组和

转移可以使动物与植物之间的遗传信息进行相互重组和转移可以使人与其他生物间的遗传信息进行相互重组和转移大大缩短了育种年限

2.1基因工程概况

2.2.1DNA

2.2.1.1DNA的组成和结构

DNA由腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成。脱氧核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸基组成。四种脱氧核苷酸的脱氧核糖、磷酸基的结构和位置相同，只是各自的碱基不同。

2.2

DNA重组

2.2.1.1DNA的组成和结构组成：碱基有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4种。脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键连接。多个脱氧核苷酸按此方法连接成多聚脱氧核苷酸，其一端为游离的5´-磷酸基(5´­P)称为5´端；另一端为游离的3´-羟基(3´­OH),称为3’端。

2.2

DNA重组

2.2.1.1DNA的组成和结构

DNA的双螺旋结构

DNA两条脱氧核苷酸链总是按照碱基A与T互补配对和G与C互补配对的，通过氢键形成稳定的双螺旋结构，称为双链DNA。少数病毒和噬菌体中的DNA是以单链形式存在的。2.2.1.1DNA的组成和结构碱基的互补配对和书写方式

2.2

DNA重组

2.2.1.2DNA的功能

（1）DNA分子能在细胞内复制以原有的DNA链为模板，从特定的复制起始位点（ori）起始，复制出新的DNA链。

（2）DNA是基因的主要携带者

一个基因是DNA分子上的一个特定的核苷酸序列。2.2.1.2DNA的功能原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列Pribnow框或-10区：-4~-13bp之间由６个核苷酸组成，多数是TATAAT序列。-35区：-35bp前后保守的TTGACA序列。动、植物基因启动子相关的保守核苷酸序列生物类型

TATA区（-25~-30）

CAAT区（-70~-80）

GC区（-80~-100）动物TATAATAGGCCAACTGCCACACCC植物TCTATATA1~3CA或TGTATAAA1~3CACA2~5GNGA2~4CC或TA2~5TNGA2~4TTGGGCGGG2.2.1.2DNA的功能终止子发夹结构序列2.2

DNA重组2.2.2获得DNA片段的主要途径目的：（1）获得含有基因的DNA片段（2）获得含有基因表达调控因子的DNA片段（3）获得含有与基因重组有关的核苷酸序列的DNA片段主要途径：

（1）限制性内切核酸酶酶切法（2）PCR扩增法（3）化学合成法2.2.2获得DNA片段的主要途径2.2.2.1限制性内切核酸酶和DNA片段化

限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)

功能：能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并在合适的反应条件下,使每条链的一个磷酸二酯键断开,产生具有3´­OH和5´­P的DNA片段。

命名：HindIII由HaemophilusinfluenzaeRd中属名的H,种名的in和菌株代号的d组成,III表示从此菌株中提取的第三种限制性内切核酸酶。

识别序列规律：旋转对称或左右互补对称。

切割位点:在识别序列上使磷酸二酯键断开的位置。

粘性末端：产生的DNA片段末端的一条链多出一至几个核苷酸。3´端比5´端长的称为3´粘性末端，5´端比3´端长的称为5´粘性末端。平末端：产生的DNA片段末端是平齐的。限制性内切核酸酶识别序列、酶切位点和酶切片段末端2.2.2.1限制性内切核酸酶和DNA片段化

2.2.2.1限制性内切核酸酶和DNA片段化

限制性内切核酸酶的切割方法:单酶切法双酶切法完全酶切法部分酶切方法2.2.2获得DNA片段的主要途径2.2.2.2

特异性DNA片段的PCR扩增特点：扩增特异DNA片段。一个待扩增的DNA片段，在3h内可扩增出约106个这样的DNA片段。关键因子：

※引物

※dNTP※模板DNA

※耐热性DNA聚合酶2.2.2.2

特异性DNA片段的PCR扩增耐热性DNA聚合酶普通耐热DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶和TthDNA聚合酶等）高保真耐热DNA聚合酶（如PfuDNA聚合酶和VentDNA聚合酶）长片段耐热DNA聚合酶（如LongTaqDNA聚合酶）热启动耐热DNA聚合酶（如HotstarTaqDNA聚合酶）测序用途的耐热DNA聚合酶（如BcaBestDNA聚合酶和SacDNA聚合酶）等。2.2.2.2

特异性DNA片段的PCR扩增反应过程：※反应系统加热至90~95℃,底物双链DNA变性成为两条单链DNA；※降温至37~60℃,使引物与模板DNA链互补序列杂交(复性

)；※升温至70~75℃，耐热性DNA聚合酶催化引物按5´→3´方向延伸,合成模板DNA链的互补链(延申)。※重复以上过程，一般经过25～30次循环片段。2.2.2.2

特异性DNA片段的PCR扩增扩增示意图2.2.2获得DNA片段的主要途径2.2.2.3化学合成目的基因

根据待合成的DNA片段预定的核苷酸序列，采用DNA合成仪，将4种核苷酸单体按3´→5´磷酸酯键连接成寡核苷酸片段。DNA合成仪合成引物合成寡核苷酸连杆合成基因片段2.2.3DNA片段的连接2.2.3.1DNA连接酶（DNAligase）催化机理：催化双链DNA片段紧靠在一起的3´­OH末端与5´­P末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。目前常用的连接酶：

E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶T4RNA连接酶热稳定连接酶2.2.3DNA片段的连接具互补粘性末端片段之间的连接2.2.3.2DNA片段之间的连接2.2.3DNA片段的连接具平末端DNA片段之间的连接2.2.3.2DNA片段之间的连接DNA片段末端修饰后进行连接2.2.3DNA片段的连接2.2.3.2DNA片段之间的连接2.2.3DNA片段的连接2.2.3.2DNA片段之间的连接DNA片段末端修饰后进行连接2.2.3DNA片段的连接2.2.3.2DNA片段之间的连接

DNA片段加连杆后或加衔接头连接2.2.3DNA片段的连接

2.2.3.3DNA重组类型

插入重组置换重组2.3基因克隆载体基因克隆载体的含义

能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相对稳定维持的DNA分子称为基因克隆载体（genecloningvector）。基因克隆载体应具备的基本条件具有1个或多个克隆位点。进入受体细胞后，一般是能够以不同的形式进行复制。含有供选择克隆子的标记基因。克隆载体必须是安全的。2.3基因克隆载体克隆载体种类按构建克隆载体的材料来源分:

质粒克隆载体、病毒（噬菌体）克隆载体、线粒体克隆载体、

人工染色体克隆载体、叶绿体克隆载体......按克隆载体的用途分:

一般克隆载体、表达载体、建库载体、T或U载体......

按克隆载体的受体生物分:原核生物克隆载体：

大肠杆菌克隆载体、放线菌克隆载体......真核生物克隆载体酵母克隆载体、植物克隆载体、动物克隆载体、

人克隆载体......

2.3基因克隆载体2.3基因克隆载体含义：以质粒DNA分子为基础构建的克隆载体，必须含有质粒的复制起始位点。种类：

大肠杆菌质粒载体蓝藻穿梭质粒载体农杆菌Ti质粒载体酵母2μm质粒载体

......2.3.1质粒克隆载体质粒DNA2.3.1质粒克隆载体pBR322简图2.3.1质粒克隆载体2.3.1质粒克隆载体2.3.1质粒克隆载体2.3.1质粒克隆载体2.3基因克隆载体含义

以病毒（噬菌体）DNA或cDNA为主构建的克隆载体，或者通过转染直接进入宿主细胞，或者包装成病毒颗粒后通过转导进入宿主细胞。种类

噬菌体克隆载体：

λ噬菌体克隆载体

Cosmid载体

植物病毒克隆载体：CaMV克隆载体

动物病毒克隆载体：痘苗病毒载体腺病毒载体反转录病毒克隆载体2.3.2病毒（噬菌体）克隆载体2.3.2病毒（噬菌体）克隆载体入噬菌体载体gtwes-λB

2.3.2病毒（噬菌体）克隆载体2.3.2病毒（噬菌体）克隆载体痘苗病毒载体示意图2.3.3人工染色体载体——大DNA片段克隆载体（1）含义：指能在宿主细胞中稳定地复制并准确传递给子细胞的人工构建的染色体。（2）特点：能容纳长达1000kb以上的外源DNA片段。（3）用途：构建基因组文库,克隆和转移完整的高分子量基因,基因功能鉴定,基因治疗……

2.3基因克隆载体2.3.3人工染色体载体——大DNA片段克隆载体（4）类型：线形的人工染色体：必须含有端粒、着丝粒和复制起始区。包含：酵母人工染色体（YAC)人类人工染色体（HAC)哺乳动物人工染色体（MAC)环形的人工染色体：不需要端粒和着丝粒，

必须含有合适的复制起始区。包含：细菌人工染色体(BAC)

源于噬菌体Ｐ1的人工染色体(PAC)

双元细菌人工染色体(BIBAC)

可转化人工染色体(TAC)2.3.3人工染色体载体——大DNA片段克隆载体2.3.3人工染色体载体——大DNA片段克隆载体2.3.3人工染色体载体——大DNA片段克隆载体2.3.3人工染色体载体——大DNA片段克隆载体2.3基因克隆载体

2.3.4体内同源重组整合载体（系统）2.3.4.1常规基因整合平台系统

内源平台双交换置换载体内源平台双交换插入载体内源平台单交换插入载体外源平台双交换插入载体2.3.4.1常规基因整合平台系统

2.3.4体内同源重组整合载体（系统）2.3.4.2基于噬菌体P1的Cre/lox定位重组系统loxP位点序列示意图2.3.4.2基于噬菌体P1的Cre/lox定位重组系统2.4获得目的基因2.4.1目的基因来源

目的基因：在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。

目的基因的生物来源:真核生物染色体基因组原核生物染色体基因组质粒基因组病毒（噬菌体）基因组

线粒体基因组叶绿体基因组

2.4获得目的基因2.4.2分离目的基因的途径2.4.2.1利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离

目的基因

2.4.2分离目的基因的途径2.4.2.2利用PCR直接扩增目的基因PCR扩增含目的基因DNA示意2.4.2分离目的基因的途径2.4.2.3目的基因的化学合成2.4.2分离目的基因的途径2.4.2.4通过构建基因组文库或cDNA文库分离的基因2.4.2分离目的基因的途径2.4.2.4通过构建基因组文库或cDNA文库分离目的基因2.5目的基因导入受体细胞

2.5.1受体细胞

2.5.1.1原核生物

种类：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌、棒状杆菌、放线菌等2.5目的基因导入受体细胞

2.5.1.1原核生物

特点：大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入;没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦;基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单,繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。2.5.1受体细胞

2.5.1.2真核生物种类：

酵母：基因结构相对比较简单，便于基因工程操作；

培养简单，适于大规模发酵生产，成本低廉；基因表达产物能分泌到培养基中,便于产物的提取加工;

不含特异性的病毒，不产生毒素，是安全的受体细胞。植物细胞：具全能性。

有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草和拟南芥等。动物细胞：多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞以及干细胞。

有猪、羊、牛、鱼、鼠、猴等。2.5.1受体细胞2.5.1.2真核生物特点：真核生物细胞具备真核基因表达调控以及表达产物加工和分泌等的机制，因此作为受体细胞表达真核基因优于原核生物细胞。

真核细胞模式图2.5目的基因导入受体细胞

2.5.2重组DNA分子导入受体细胞化合物诱导转化法根癌农杆菌介导转化法

电穿孔转化法微弹轰击(基因枪)转化法激光微束穿孔转化法超声波处理转化法

脂质体介导转化法

体内注射转化法花粉管通道转化法

精子介导法低能离子束介导转化法2.5.2.1外源DNA转化方法2.5.2外源DNA导入受体细胞2.5.2.2病毒(噬菌体)颗粒转导法

用病毒(噬菌体)的DNA（或cDNA）构建成重组DNA，在体外包装成重组病毒(噬菌体)颗粒，通过感染使重组DNA进入受体细胞。

方式：重组病毒直接感染受体细胞重组病毒同另一辅助病毒一起感染受体细胞重组病毒感染互补型受体细胞系适用：主要用于基因组文库或cDNA文库的构建和动植物的转基因。2.5.2.2病毒(噬菌体)颗粒转导法2.5.2外源DNA导入受体细胞2.5.3克隆子的筛选2.5.3.1根据载体标记基因筛选转化子根据载体抗菌素抗性基因筛选转化子根据载体除草剂抗性基因筛选转化子根据LacZ´基因互补显色筛选转化子根据生长调节剂非依赖型筛选转化子根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补筛

选转化子2.5.2外源DNA导入受体细胞2.5.3克隆子的筛选2.5.3.2根据报告基因筛选转化子β-葡萄糖酸苷酶基因（gus）

萤火虫荧光素酶基因（luc）绿色荧光蛋白基因（gfp）2.5.3.3根据形成噬菌斑筛选转化子

2.6重组子的鉴定2.6.1根据重组DNA分子特征鉴定重组子

2.6.1.1根据重组DNA分子大小鉴定重组子2.6.1.2根据重组DNA分子酶切图谱鉴定重组子2.6.1.3根据PCR扩增片段鉴定重组子2.6.1.4采用DNA分子杂交法鉴定重组子Southern印迹杂交斑点印迹杂交菌落（或噬菌斑）