DB21∕T 1958-2012 水产动物 DNA鉴定 线粒体COI基因序列法

ICSFORMTEXT65.150FORMTEXTB50FORMTEXTDBFORMTEXT21DBFORMTEXT21/FORMTEXTT1958—FORMTEXT2012FORMTEXTFORMTEXT水产动物DNA鉴定线粒体COI基因序列法FORMTEXTMitochondrialCOIgenetodetectgermplasmforaquaculturespeciesFORMTEXT点击此处添加与国际标准一致性程度的标识FORMDROPDOWNFORMTEXT（本稿完成日期：2011-12-20）FORMTEXT2012–FORMTEXT02–FORMTEXT20发布FORMTEXT2012–FORMTEXT03–FORMTEXT20实施FORMTEXT辽宁省质量技术监督局发布DB21/XXXXX—XXXXI前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准由辽宁省海洋与渔业厅归口。本标准主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准主要起草人：赫崇波，李云峰，刘卫东，高祥刚，鲍相勃，苏浩。本标准首次发布。水产动物DNA鉴定线粒体COI基因序列法范围本标准规定了水产动物DNA鉴定线粒体COI基因序列法的原理、试剂、仪器、分析步骤和结果判定。本标准适用于水产动物DNA鉴定等方面的种质检验工作。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GA/T383-2002法庭科学DNA实验室检验规范SN/T1193-2003基因检验实验室技术要求术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。细胞色素c氧化酶亚基I(CytochromeCoxidaseI,COI)线粒体(mitochondrion)真核细胞中由双层高度特化的单位膜围成的细胞器。DNA序列测定(DNAsequencing)测定DNA分子的核苷酸序列。序列比对(alignment)为确定两个或多个序列之间的相似性以至于同源性，而将他们按照一定的规律排列。原理线粒体COI基因是位于线粒体DNA的蛋白质编码基因，其长度为600bp左右易于扩增，进化速度较快同时又相对保守，既有足够的变异又便于通用引物扩增，DNA序列很少有插入与缺失现象，便于序列比对分析。利用通用引物对水产动物线粒体COI进行PCR扩增，得到目的片段进行纯化、测序，只要将所有序列进行两两比较并计算其差异值，然后根据差异值来确定物种之间的关系。试剂裂解液核苷酸(RNA)酶三羟甲基氨基甲烷饱和酚(Tris饱和酚)三氯甲烷异戊醇无水乙醇溴化乙锭（10mg/mL）10×Tris硼酸(10×TBE)电泳缓冲液6上样缓冲液100bpDNA分子量标记琼脂糖：分析纯蛋白酶K（20mg/mL）TaqDNA聚合酶（5U/L）分子量标准(markers)超纯水仪器凝胶成像分析系统PCR仪低温高速离心机稳压稳流电泳仪单道可调移液器（2L，10L，20L，电子天平（量程0.01-300mg）水浴恒温震荡器电泳槽普通离心机紫外分光光度计超声波清洗器超纯水器遗传分析仪分析步骤鉴定样品待鉴定样品可以是皮毛、肌肉、骨骼、各种器官、组织、血液等，可以通过冷冻、冰鲜、酒精保存。鉴定材料处理通过现场或实验室取样，将采集到的样品（如：肌肉、肝脏、鱼卵、鱼鳍等）用蒸馏水洗净后放入盛有75％酒精的离心管中，4℃保存待用基因组DNA的提取把取回样品用蒸馏水洗净后，用标准的SDS变性（或CTAB变性）、蛋白酶K消化和酚／氯仿抽提方法提取总DNA，具体操作参照《分子克隆实验指南（第3版）》等的方法沉淀DNA，收集絮状沉淀，用70%乙醇洗涤两次，室温干燥后加入适量TE溶解DNA。DNA纯度检测吸取1-3µL提取的DNA，用1–2％琼脂糖凝胶100V电泳30min，检测所提取DNA的质量。如果DNA条带比较整齐、亮度较高，则说明提取的DNA质量较好。DNA浓度检测紫外吸收定性测试分别于260nm波长和280nm波长下测定产物（或产物稀释液）的紫外吸收值。确定A260／A280比值在1.8–2.0范围内，方可正常进行后续实验。紫外吸收定量测试DNA浓度(μg/mL)=[A260／(0.020×L)]×稀释倍数，式中A260为被测样品在260nm波长下的吸光度值，L为比色池厚度，单位cm。应保证DNA浓度在10μg/mL以上，方可正常进行后续实验。线粒体特异性引物设计采用无脊椎动物通用引物正向(F)：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；反向(R)：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。鱼类正向引物：TCAACCAACCACAAAGACATTGGC；反向引物：TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。线粒体DNA片段扩增和测序利用设计好的线粒体特异性引物，对提取的DNA样品进行PCR扩增，对得到的特异性PCR产物进行回收和纯化后，用遗传分析仪进行PCR产物直接双向测序。数据分析和种类鉴定利用NCBI(美国国立生物技术信息中心)的GenBank数据库的Blastn基因搜索程序对待鉴定个体的DNA序列进行比对分析，根据差异值来确定物种之间的关系。一般情况下，序列相似度≥98%确定为同一物种。同一种水产动物由于不同的地理种群的遗传分化，可能导致序