毒理学基础实验指导

卫生毒理学实验指导编写：陈秉符古雅2009年3月目录实验一毒理学实验设计1实验二实验动物的一般操作技术10实验三灭多威经口急性毒性试验20实验四苯经呼吸道急性毒性试验24实验五蓄积毒性试验27实验六亚慢性和慢性毒性试验29实验七小鼠骨髓细胞微核试验33实验八小鼠精子畸形试验37实验九骨髓细胞染色体畸变分析40实验十鼠伤寒沙门菌回复突变试验42实验十一致畸试验及胚胎胎仔检查方法47实验十二网织红细胞计数53附录：动物实验报告的撰写及考前须知54实验一毒理学实验设计一、目的和意义毒理学的很多研究工作需要通过动物实验来进行。使用实验动物进行科研的优点是花费人力、物力较少，时间短，易发现单因素与结果的关系，能提供大量有价值的可与人类生命活动现象相类比的资料。在毒理学实验研究中，健康的实验动物是保证工作顺利进行和获得正确可靠的研究结果的重要条件。毒理学研究外源化学物对于机体(特别是人体)的有害作用及其机制。毒理学研究的主要手段是动物实验。体内试验是以实验动物为模型，最终目的是通过外源化学物对实验动物的毒性反响，向人(原型)外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。体外实验主要用于筛选和预测急性毒性和机制研究；人体实验和流行病学调查那么可进一步深化和证实在动物实验中所得到的资料。实际上，毒理学作为一门实验科学是以动物实验为中心的，毒理学动物实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学研究的根本方法。通过本次讨论，要求学生根本掌握毒理学实验设计的原那么和方法。二、内容〔一〕毒理学实验的原那么和局限性1、毒理学实验的原那么在毒理学的试验中，有三个根本的原那么。第一个原那么，化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人。第二个原那么，实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需的和可靠的方法。第三个原那么，成年健康(雄性和雌性未孕)的实验动物和人可能的暴露途径是根本的选择。2、毒理学实验的局限性用实验动物的毒理学实验资料外推到人群接触的平安性时，会有很大的不确定性。〔二〕毒理学常规毒性试验的根本目的毒性评价或平安性评价方面的根本目的包括以下几点：1.受试物毒作用的表现和性质。2.剂量-反响(效应)研究。3.确定毒作用的靶器官。4.确定损害的可逆性。毒理学研究还可能有其他的目的和要求，例如毒作用的敏感检测指标和生物学标志、毒作用机制研究、受试物的毒物动力学和代谢研究、中毒的解救措施等。对这些要求，应扩展常规试验的设计以包括有关的工程，或者另外设计和进行靶器官毒理学研究及机制毒理学研究。〔三〕实验动物的选择毒理学的动物实验是以实验动物作为研究对象的，为获得可靠的研究结果，先决条件是正确地选用实验动物。1、实验动物物种的选择对实验动物物种选择的根本原那么是：选择对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种；自然寿命不太长的物种；易于饲养和实验操作的物种；经济并易于获得的物种。在毒理学研究中常用的实验动物物种如下：大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的实验动物有地鼠、猕猴、小型猪、鸡等。常用实验动物生物学和生理学参数见表1-1。以上实验动物各物种中，实际上没有一种完全符合上述物种选择的原那么，目前常规选择物种的方式是利用两个物种，一种是啮齿类，另一种是非啮齿类。系统毒性研究最常用的啮齿类是大鼠和小鼠，非啮齿类是狗。豚鼠常用于皮肤刺激试验和致敏试验，兔常用于皮肤刺激试验和眼刺激试验。遗传毒理学试验多用小鼠，致癌试验常用大鼠和小鼠，致畸试验常用大鼠、小鼠和兔。迟发性神经毒性试验常用母鸡。表1-1常用实验动物生物学和生理学参数参数猴狗猫兔大鼠小鼠豚鼠地鼠成体体重(kg)35寿命(a)1615146331水消耗(ml/d)4503503203003561453015040010018010512101588080110130600100250体温(℃)38.639l38l37.438.638.0呼吸频率50202553851609083(次／min)(40～60)(10～30)(20～30)(40～65)(65～110)(80～240)(70～100)(35～130)心率(次／min)200100120200328600300450血压mmHg159／127148／100155／100110／80130/90120／7577/50108/77(收缩／舒张)出生体重(g)500～7001251005-675～100断乳时体重(g)440058003000100～150040～5010～1225035开眼(d)出生当天8～128～121010～1211出生当天15妊娠(d)16863633121206716性周期(d)282215～2815～164～54～516～194动情期(d)1～27～139～19301111窝数量13～61～61～136～91～121～51～12断乳年龄(周)16～2466～983～4323～4生殖年龄(月)549106～72～3232生殖期(年)10～155～1041～31131生殖季节任何时间春，秋任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间所需面积(tf2)*68330.40.40.7环境温度(℃)18～2818～2818～2818～2819～2519～2519～2519～25血容量(ML/Kg)7579605365807585凝血时间(s)90180120300601460143HCT(％红细胞)4245404246414250Hb(g／bl)16.011.813.614.816.012.42、实验动物品系的选择品系(strain)是实验动物学的专用名词，指用方案交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。实验动物按遗传学控制分类可分为：①近交系：指全同胞兄妹或亲子之间连续交配20代以上而培育的纯品系动物。如小鼠有津白I、津白Ⅱ、615，DBA／1和DBA／2，BALB/C，C3H，C57B／6J，A和A／He等。②杂交群动物(杂交1代，F1)，指两个不同的近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物。③封闭群：一个种群在五年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。如昆明种小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD(Sprague-Dauley)大鼠等。根据实验动物遗传的均一性排序，近交系最高、杂交群次之、封闭群较低。不同品系实验动物对外源化学物毒性反响有差异，所以毒理学研究要选择适宜的品系，对某种外源化学物毒理学系列研究中应固定使用同一品系动物，以求研究结果的稳定性。遗传毒理学一般利用啮齿类动物，主要是小鼠或大鼠。如果有适宜的理由，其他物种也可接受。有的文献报告在小鼠骨髓微核试验MS／Ae品系比ddy，CD-1或BDF品系更敏感。但一般认为还没能证明某一品系对所有的遗传毒性物质比其他品系都敏感。在致癌试验中对实验动物的品系有一定的要求，特别重视有关病理损害的自发发生率。3、对实验动物微生物控制的选择按微生物控制分类，实验动物分为四级，见表1-2。对于毒性试验及毒理学研究应尽可能使用二级(或二级以上)的动物，以保证实验结果的可靠性。表1-2实验动物微生物等级级别要求I级Ⅱ级Ⅲ级IV级普通动物，应没有传染给人的疾病清洁动物，除I级标准外，种系清楚，没有该动物特有的疾病无特定病原体动物(SPF)，除Ⅱ级标准外，动物为剖腹产或子宫切除产、按纯系要求繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，可有不致病细菌丛，没有致病病原体无菌动物，在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不带有任何微生物和寄生虫(包括绝大局部病毒)4、个体选择实验动物对外来化学物的毒性反响还存在个体差异，应注意实验动物的个体选择。〔1〕.性别同一物种、同一品系的实验动物雌雄两性通常对相同外源化学物毒性反响类似但雌雄两性对化学物的毒性敏感性上存在着差异。如果不同性别的动物对受试物敏感性不同，应选择敏感的性别。如对性别差异不清楚，那么应选用雌雄两种性别。如实验中发现存在性别差异，那么应将不同性别动物的实验结果分别统计分析。在遗传毒理学体内试验中，对性别的选择有几种意见：①对单个物种应用两种性别。②对单个物种应用两种性别，除非已在一个性别得到阳性反响，就不必对另一种性别进行试验。③对单个物种应用两种性别，除非经毒代动力学研究证明受试物(和其代谢产物)在雄性和雌性无差异和／或如果在确定剂量的预试验证明有相等毒性。此假定在非遗传毒性与遗传毒性之间有相关。④对单个物种常规用一种性别(雄性或雌性)，除非预期／证明存在性别差异。由于历史的原因UDS体内／体外试验常规用雄性大鼠。一般来说，对于初次试验的受试物，应该采用两种性别。对大鼠和小鼠各一种性别进行试验可能比单个物种两种性别提供更好的危害鉴定，但这需要更多的资料来证明。〔2〕.年龄和体重〔3〕.生理状态〔4〕.健康状况(四)毒理学试验设计要点1、体内试验设计1〕.剂量分组在毒理学试验中，最重要的就是研究剂量-反响(效应)关系，也就是当外源化学物染毒剂量增加，实验动物的毒性反响(效应)随之而增强。剂量-反响(效应)关系的存在是确定外源化学物与有害作用的因果关系的重要依据，也可证明实验结果的可靠性。因此，在毒理学试验中，一般至少要设3个剂量组(即高剂量组、中剂量组、低剂量组)，希望能得到满意的剂量-反响(效应)关系。特别注意设立对照组：未处理对照组(以前有称为空白对照组)：阴性(溶剂/赋形剂)对照：阳性对照：④历史性对照：2〕.各组动物数3〕.试验期限2、体外试验设计1〕．测定受试物溶解性2〕．试验最高剂量的推荐3〕.代谢活化4〕.阳性对照5〕.重复〔五〕实验动物的染毒和处置1、动物实验前的准备2、受试物和样品的准备3、染毒途径4、实验动物处死及生物标本采集1〕．实验动物处死方法2〕．血液采集3〕．尿液采集4〕．病理解剖、标本留取和组织病理学检查〔六〕实验结果处理和分析在毒理学试验的设计和实施中应贯彻实验设计的对照、随机和重复的原那么，实验的各剂量组所得到的结果应与阴性对照组比拟。根据实验结果(指标)的变量类型是数值变量(计量资料)还是分类变量(计数资料)，选用不同的统计分析方法。在评价毒理学试验的结果时，应综合考虑生物学意义和统计学意义。统计检验的假设是关于总体特征的假设，检验方法是以统计量的抽样分布为根据的，得到的结论是概率性的，不是绝对的肯定或否认，不等同于有或无生物学意义。对实验结果作出科学的判断和解释，应该根据统计学分析的结果、生物学知识和经验。1、毒理学试验的统计学统计学观点及方法在毒理学试验的设计和结果评价中起关键的作用，毒理学试验的开展也促进了生物统计学的开展。毒理学试验统计学评价的主要进展是剂量—反响关系研究和对超离差数据的统计。1〕.毒理学试验设计的统计学要求毒理学试验的设计应遵循随机、重复及对照三个原那么，要求各观察值具有代表性，并且是相互独立的。毒理学试验的设计具体涉及到剂量水平数目及间隔，每个剂量点的实验单位数，每个实验单位接种及计数的细胞数，对照组的设置等。实验单位确实定对于样品的独立性是很重要的，实验单位(experimentalunit)是进行处理时或观察时独立的最大采样单位。以动物和培养物作为实验单位要比以细胞作为实验单位更为可取。此外，如果同时评价几个不同因素的效应，应注意均衡的原那么，实验设计应可以区分不同因素的奉献并分别估计。样本的代表性要求具有同质性，即各处理组和对照组的非实验因素的条件均一致，为此，各实验单位(动物或培养物)的分组及整个实验的全部操作都应遵循随机化原那么。在利用形态学指标的毒理学试验，必须采用盲法观察结果，以消除实验者观察结果的偏性。样本应有足够的大小和适当的重复次数，以估计处理之间、实验室内和实验室间的变异性。一般可根据显著性水准、检验把握度、容许误差、总体标准差等来估计样本的大小。严格执行毒理学试验设计的上述要求，才可能得到可靠性和重复性良好的结果，也是进行正确的统计学评价的根底。良好的质量保证和实验设计可以监控系统误差，而统计处理那么用来确定随机误差。毒理学试验的数据通常是由剂量水平和相应观察值组成的二维关系型数据。毒理学试验处理组与阴性对照组观察值均数的比拟，如果资料可拟合某种分布，那么适用于参数检验，其敏感度和效率高于非参数检验；如资料不能拟合某些的分布，那么应进行数据转换，以满足正态性和方差齐性。如果任何变换都不能改善数据的分布，可能存在个别可疑值，应予以识别和剔除。另一方面，可使用不依赖总体分布模型的非参数统计分析。一种毒理学试验资料可以有假设干种正确的统计学分析方法，但可能不存在唯一正确的方法。其原因主要是外表上不同的统计学分析方法常以相同的统计学概念和模型为根底。另一方面，利用不同的统计学方法来评价毒理学试验资料缺乏比拟研究。①.各处理组与阴性对照组两两比拟和多个处理组与阴性对照组比拟各处理组与阴性对照组两两比拟和多个处理组与阴性对照组比拟常用的统计学方法见表1-3。表1-3各处理组与阴性对照组两两比拟和多个比拟的统计学方法类型连续性数据，正态分布离散性数据分布未知方差齐方差不齐二项分布泊松分布处理组与阴性对照组两两比拟t检验t’检验卡方检验，Fisher确切概率法，u检验u检验非参数法，如Wilcoxon秩和检验多个处理组与阴性对照组比拟Dunnett检验(1955)改良的DUNnett检验(1980)平方根反正弦转换，再用dunnett检验，或者Simes法(1986)Suissa和Salmi法(1989)非参数法，如多重比拟秩和检验(Steel，1959)②.剂量-效应关系和剂量-反响关系剂量-效应关系和剂量-反响关系是毒理学研究的重要内容。在急性毒性(LD50)研究中，就是典型的剂量-反响关系研究，LD50是统计学的点值估计和区间估计。在其他毒理学试验中的阳性剂量-效应关系和剂量-反响确实定也应通过统计学处理和判定，尽管，可以用各处理组与阴性对照组两两比拟和各处理组间两两比拟，发现高剂量组与中、低剂量组及对照组间差异有显著性，中剂量组与低剂量组和对照组间差异有显著性，低剂量组与对照组间差异无显著性，来证明有剂量-反响关系；但这种方法的效率较低。剂量-效应关系和剂量-反响的判定可以分为定性和定量统计学两大类。剂量-效应关系和剂量-反响关系的统计学定性分析即为趋势检验，而统计学定量分析那么为模型拟合。趋势检验是检验对自变量“规定的水平，反响的观察值增高或降低的趋势的显著性。当自变量s为定量数据时，那么可进行模型拟合，即剂量-反响关系的定量研究。趋势试验(trendtesting)，剂量为xi；反响为μi，当有x0＜x1＜…＜xK，无效假设为H0：μi＝μ0＝...=μK备择假设为Ha：μi≤μ0≤…≤μK或μi≥μ0≥…≥μK单调上升或单调下降趋势。如反响μi为连续资料服从正态分布，当xi为定量数据，那么可选用简单的线性回归或加权线性回归；如反响μi为离散资料服从二项分布或泊松分布，可选用Cochran-Armitage趋势检验；如果样本所属的总体分布未知，那么可利用非参数法加Jonckheere-Terstra趋势检验(Jonckheere，1954)。在毒理学数据的统计学方法中最主要的开展是剂量-反响关系的统计学方法、超离差(overdispersion)计数资料的统计学方法及广义线性模型(generalizedlinearmodel)。这些方法，可以利用统计程序包如SAS，Genstat等来实现。③.对常规毒理学试验资料推荐的统计学方法(Cad等，1994)A体重和器官重量：体重常是毒性效应最敏感的指标之一。如果每组样品量足够大(10或10个以上)，可用下述方法：器官重量计算为体重的百分比。按体重或体重改变分析。如在试验开始，动物随机化分组(各组体重均数差异无显著性，各组所有的动物体重在总平均体重的2个SD之内)，利用体重改变分析比拟好。对各组资料利用Bartlett方差齐性试验，检测方差齐性。根据方差齐性或不齐，决定进一步的统计学检验。如果样本量较小，可利用Kruskal-Wallis非参数检测。B临床化学：过去一般用t检验或ANOVA，但并非是最适当的方法。因为这些生化参数很少是彼此独立的。通常，所研究的并不是单独某一个参数，而是与靶器官毒作用有关的一组参数，如CPK，HBDH和LDH同时增高强烈指示心肌损害。这时我们并不只是注意其中一个参数的增高，而是全部3个参数。而血清电解质(如钠、钾、钙)常相互影响，一种降低常伴另一种增加。而且资料的性质，由于这些参数的生物学性质或测定的方法，常不服从正态分布(为偏态分布)或为非连续的，如肌苷、钠、钾、氯、钙和血尿素氮。临床化学资料适用的统计学方法：①ANOVA，Bartlett检验和／或F检验，t-检验，适用于：钙、葡萄糖、BUN、肌苷、胆碱脂酶、总蛋白、白蛋白、HBDH、ALP、CPK、LDH、ALT、AST及血红蛋白。②Kruskal-Wallis非参数ANOVA适用于：总胆红素、GGT。C血液学：不同物种、品系的实验动物血液学检查的数据，所服从的分布也可能是不同的。这些参数的大局部是相互有关的，并依赖于所用的测定方法。RBC数、血小板数和MCV可用仪器测定，数据适用于参数检验。红细胞压积(HCT)是由RBC和MCV得到的计算值，故依赖于此两个参数；但如直接测定，也可用参数检验。血红蛋白是直接测定的并是独立的连续数据。但如同时存在血红蛋白的多种形态(氧血红蛋白、脱氧血红蛋白、高铁血红蛋白等)，那么可能不是典型的正态分布，而呈多模型分布。此时可用wilcoxon检验或多重秩和检验。WBC总数服从正态分布，并适用于参数检验。而WBC的分类或报告为百分比或乘以WBC总数得“绝对”分类WBC数。这些资料，特别是嗜酸性粒细胞不符合正态分布，应该用非参数统计。应注意，单个参数的变化很少有生物学意义，因为这些参数是相互有关的，应注意发现并分析预期的参数变化谱。D组织病理学损害发生率：在亚慢性和慢性毒性试验，强调了组织病理学检查。统计学分析是评价处理组动物组织病理学损害发生率是否高于对照组动物。除了癌发生率外，也应注重发现其他病理损害。在处理组和对照组动物病理损害发生率比拟常用卡方检验或Fisher精确检验。利用双侧检验还是单侧检验取决于研究者的要求。对于多重比拟可用Bonferroni法，而且可利用趋势检验来评价剂量-反响关系。E生殖毒性：对生殖毒性的统计学分析，是以窝(或妊娠雌性动物)为实验单位，而不是幼体。生殖毒性试验一般可得4个变量：生育力指数(FI)、受孕指数(GI)、存活力指数(VI)和哺育指数(LI)。对这些变量，如样本数为10或10以上可利用Wilcoxon-Mann-whitneyU检验或KrusKa1-Wallis非参数ANOVA。如样本数小于10，那么可用Wilcoxon秩和检验(用于2组比拟)或Aruskal-wallis非参数ANOVA(用于3组或3组以上的比拟)。F致畸试验：每组应有20只妊娠动物。并且，实验单位为窝，而不是胎体。如样本数为10或10以上，可近似为正态，利用参数检验(如卡方检验、t-检验或ANOVA)、来评价结果。当样本数小于10，可用非参数检验(Wilcoxon秩和检验或Kruskal-wallis非参数ANOVA)。此外，Wilcoxon-Mann-whitneyU检验也广泛用于致畸试验。G饲料和染毒柜中受试物浓度分析：当受试物掺入饲料进行喂饲试验，或为气溶胶吸入试验，应定期测定饲料中受试物浓度和染毒柜中受试物气溶胶的浓度。采样应随机并有代表性。一般要求饲料或空气中浓度应在预定浓度的±10％之内；显著增高的峰浓度可能超过代谢或修复系统能力，出现急性毒作用。如果不了解饲料／空气中真实的暴露水平，可能错误地解释该受试物的低水平慢性毒性。气溶胶颗粒直径分级采样可能得到分类资料(如＞100H致突变性试验：绝大多数遗传毒理学短期试验(STT)的观察值为计数资料(如突变体数、畸变数、SCE数)或是相对数(如存活细胞的突变频率)，因此STT结果的统计学主要是对离散性资料的统计学推断。最常用的遗传毒理学试验的统计学方法：a)Ames试验的统计学评价：Ames试验的结果每平板回变菌落数的分布不完全服从泊松分析，有超离差现象；并且，其剂量反响曲线呈先上升后下降的伞形。Ames等l975年提出2倍判断标准，在1983年改良的方法中已不再推荐。2倍判断标准有较大的缺点，此判断标准不是统计学判断，对自发回变率较高的菌株偏严，而对自发回变率较低的菌株偏松。已开展了几种统计学方法用于Ames试验的假设检验和剂量反响研究。Kim和Margolin等(1999)利用基于生物学的机制模型，开展了SALM程序，用于Ames试验结果的判断。b)遗传毒理学体内试验：(包括微核试验、染色体畸变试验和显性致死试验)的统计学评价：Adler等(1998)提出了3步法。①确定实验结果是否可接受。如果同时进行的阴性对照的均数在历史性对照的均数±3SD之内，那么该实验结果可以接受。如果不接受，那么应重新进行实验。②剂量-反响分析。利用同时进行的阴性对照资料进行剂量-反响趋势检验。有统计学显著性的阳性趋势说明受试物处理的效应。③评价各个处理组反响，然后将各个处理组的均数分别与历史性阴性对照比拟，如各个处理组均未显示差异显著性，但趋势检验有显著性意义，此实验结果的解释需要生物学判断。如果趋势无显著性，但经多重比拟校正后仅一个处理组与历史性阴性对照比拟差异有显著性(SimesRJ．Biometricsl986；73：751-754)，那么此试验结果的解释也需要生物学判断。这时，可认为该实验的结果为可疑。同时阴性对照与历史性对照→重新试验(均数±3SD)比拟在范围之外↓在范围之内用同时阴性对照进行趋势检验有显著性↓↓无显著性各处理组与历史各处理组与历史性阴性对照比拟性阴性对照比拟有显著性↓无显著性有显著性↓有显著性阳性可疑阴性图5-2遗传毒理学体内试验统计学评价的程序。I行为毒理学：行为毒理学试验一般得到4种类型的资料：①观察的记分值，来自开阔场试验等；②反响率，来自舔液，总活动或压杆；③错误率，来自学习-记忆试验④到达终点的时间。对这些数据常用的和推荐的统计学方法见表1-4。行为发育毒性和生殖毒性研究的统计学方法也见表1-4，在断乳前应以窝为实验单位进行统计。表1-4行为毒理学的统计学方法(Gad等，1994)观察类型常用的方法推荐的方法观察记分值t检验或单例ANOVAKruskal-Wallis非参数ANOVA或Wilcoxon秩和检验反响率t检验或单侧ANOVAKruskal—wallisANOVA或一侧ANOVA错误率ANOVA检验，再进行Posthoc检验Fisher精确检验或R×C卡方，Mann—WhitneyU检验到达终点时间t检验或—侧ANOVAANOVA检验再进行Posthoc检验或Kruskal-WallisANOVAA行为发育或生殖试验ANOVA检验，再分别进行检验Fisher精确检验或Kruskal-Wallis非参数AN0VA或Mann-WhitueyU检验2、统计学意义和生物学意义在评价毒理学试验结果时，要综合评价实验结果的统计学意义和生物学意义。一般来说，具有统计学意义是具有生物学意义的必要条件之一。正确地利用统计学假设检验的结果有助于确定实验结果的生物学关联。在判断生物学意义(即生物学重要性)时，可考虑以下步骤。(1)纵向比拟：此参数的改变有无剂量-反响关系。化学物毒作用的剂量-反响关系是毒理学研究的根本假设。当某参数的改变存在阳性剂量-反响关系，就可认为此参数的改变与受试物染毒有关，具有生物学意义。(2)横向比拟：此参数的改变是否伴有其他相关参数的改变。例如，生化参数很少是彼此独立的，单个剂量组的一个参数有统计学显著性的改变一般不认为有生物学意义，除非此改变为其他参数改变所支持。如没有骨髓或脾组织学改变或没有高铁血红蛋白生成，那么单有红细胞计数的改变是没有生物学意义的。同样，在免疫毒理学中，单有淋巴细胞计数的改变不伴有淋巴结组织学改变也可能是没有生物学意义的。(3)与历史性对照比拟：由于目前尚无公认的实验动物参考“正常”值，应由本实验室利用相同品系的实验动物和相同的溶剂，进行至少10次独立实验的阴性(溶剂)对照的资料构成，以其均值±1.96×标准误作为参考值的范围。同时进行的阴性对照应在历史性对照的均数±3SD范围之内，否那么应重新试验。另有认为，凡某种观察值与对照组比拟，差异具有统计学显著性(P<)，并符合以下情况之一者，即可认为已偏离正常参考值范围，属于有害作用。①其数值不在正常参考值范围之内；②其数值在正常参考值范围之内，但在停止接触后，此种差异仍持续一段时间；③其数值在正常参考值范围之内，但如机体处于功能或生化应激状态下，此种差异更加明显。应该指出，后两种情况需要附加的试验设计。另外，还有一些其他的考虑。如处理组同时与对照组两组均数之差值应超过检测误差的两倍以上。某些血液生化指标(如AST、ALT等)的测定值升高才有生物学意义。当处理组数据与阴性对照组比拟差异有显著性，并且经分析认为是与处理有关的生物学效应，应进一步判断其为有害效应还是非有害效应。决定一种效应是否为有害作用需要专家的判断。不同指标或参数的生物学意义和重要性是不同的。在分析和综合评价实验结果的统计学意义和生物学意义时，可能遇到四种情况，见表1-5。在此表中，第Ⅰ和第Ⅳ种情况最为常见，第Ⅰ种情况是无统计学意义也无生物学意义，第Ⅳ种情况是有统计学意义也有生物学意义。但是有时在实验结果中会出现第Ⅱ和第Ⅲ种情况。表1-5毒理学试验结果的统计学意义和生物学意义生物学意义统计学意义无有无有ⅠⅢⅡⅣ第Ⅲ种情况是有统计学意义但无生物学意义，例如在某个亚慢性毒性试验中，中剂量组动物血液白细胞计数低于阴性对照组，差异有显著性(P<)，而高剂量组和低剂量组动物血白细胞计数与阴性对照组比拟差异无显著性(P>0.05)。由于在此实验结果中未出现剂量-反响关系，因此中剂量组血液白细胞计数降低可能是由于偶然因素造成的，没有生物学意义。但是，如果仅在高剂量组动物血液白细胞计数降低，与阴性对照组比拟差异有显著性〔P<〕时，必须仔细地核实高剂量组的资料。如果资料无任何疑问，可认为此变化可能具有生物学意义。最好是重新进行一个亚慢性毒性试验，并加大受试物的剂量，如果能够观察到剂量-反响关系，那么说明此剂量组血白细胞计数降低是有生物学意义的；如果加大受试物剂量没有观察到剂量-反响关系，才可以说此剂量组血白细胞计数降低没有生物学意义。因此，在判断实验结果的生物学意义时，有无剂量-反响关系是关键。有统计学意义但无生物学意义的情况，更常见的是因为实验设计和实施不良所致。第Ⅱ种情况是具有生物学意义但无统计学意义，这可能是因为该事件的发生是极端罕见的，例如在哺乳动物致癌试验中，在染毒组中出现对照组中没有的肿瘤类型，尽管从统计学上此种肿瘤的发生率很低，与对照组比拟差异无显著性(P>0.05)，但还应该认为是有生物学意义的。利用一种以上的实验动物，当某种效应在一个物种出现而在另一物种不出现，或一个物种远比另一物种敏感时，那么使结果的解释复杂化，难以确定以哪个物种的实验结果外推到人最为适宜。除非有足够的资料(通常是比拟毒动学或毒效学资料)可以说明最适宜的物种，一般是以最敏感的物种来确定NOAEL和平安限值。以上我们讨论了毒理学动物实验的根底，介绍了对外源化学物进行毒性评价的实验设计、实施、结果分析等各个环节。实验的质量控制是保证实验数据具有科学性、准确性和公正性的先决条件。没有质量保证，实验数据的可靠性是无法肯定的。我们在平安性毒理学试验设计、实施、总结报告的各个环节上，应该自觉、主动地遵循GLP原那么，逐步从人员的组成和职责、设施、设备、质量保证部门(QAU)、标准操作规程(SOP)、受试品与对照品、实施方案、实验记录和总结报告等各个方面落实GLP。实验二实验动物的一般操作技术一、目的和意义毒理学研究需要用实验动物来进行各种实验，通过对动物的实验观察和分析来研究毒作用，获得毒物的毒性、剂量—反响关系、毒作用机制等方面的资料，因此动物实验是毒理学研究中重要的手段之一。通过本次实习学习毒理学实验中有关动物实验的根本操作技术，掌握实验动物的选择、动物抓取、染毒方法和生物材料的采集等技术。二、内容(一)健康动物的选择无论选择哪种种属品系的动物进行实验，均要求选择健康的实验动物。健康动物检查时要求到达：外观体形饱满，被毛浓密有光泽、紧贴体表，眼睛明亮，行动迅速，反响灵活，食欲及营养状况良好。选择时重点检查以下工程：1．眼睛明亮，瞳孔双侧等圆，无分泌物。2．耳耳道五分泌物溢出，耳壳无脓疮。3．鼻无喷嚏，无浆性粘液分泌物。4．皮肤无创伤、无脓疮、疥癣、湿疹。5．颈部要求颈项端正，如有歪斜提示可能存在内耳疾患，不应选作实验动物。6，消化道无呕吐、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。7．神经系统无震颤、麻痹。假设动物(大鼠、小鼠)出现圆圈动作或提尾倒置呈圆圈摆动,应放弃该动物。8．四肢及尾四肢、趾及尾无红肿及溃疡。(二)实验动物的性别鉴定动物性别不同对毒物的敏感性也不同，这可能与性激素、肝微粒体羟基化反响有关，也随受试物而异。因此，要根据实验要求选择性别，一般实验如对性别无特殊要求者，宜选用雌雄动物各半。1．大鼠、小鼠主要依肛门与生殖器孔间的距离加以区分。间距大者为雄性，小者为雌性。雌性生殖器与肛门之间有一无毛小沟，距离较近。雄性可见明显的阴囊，生殖器突起较雌鼠大,肛门和生殖器之间长毛。另外成年雄性卧位可见到睾丸,雌性在腹部可见乳头。图2-1雌雄动物肛门与外生殖器间距离2．豚鼠用一只手抓住豚鼠颈部，另一只手扒开靠生殖器孔的皮肤，雄性动物在圆孔中露出性器官的突起，雌性动物那么显出三角形间隙，成年雌性豚鼠胸部有两个乳头。3．家兔将家兔头轻轻夹在实验者左腋窝下，左手按住腰背部，右手拉开尾巴并将尾巴夹在中指和无名指中间，然后用拇指和食指稍稍把生殖器附近的皮肤扒开。雄兔即可见到一圆孔中露出圆锥形稍向下弯曲的阴茎(但幼年雄兔看不到明显的阴茎，只能看到圆孔中有凸起物，即是阴茎)。雌兔此处那么为一条朝向尾巴的长缝，呈椭圆形的间隙，间隙越向下越窄，此即为阴道开口处。图2-2兔雌雄生殖器外型特征与差异(三)实验动物的抓取方法正确地抓取固定动物，是为了在不损害动物健康、不影响观察指标、并防止被动物咬伤的前提下，确保实验顺利进行。1．小鼠的抓取方法首先用右手从笼盒内抓取鼠尾提起，注意不可抓尾尖〔见图A〕，放在鼠笼盖或实验台上向后拉〔见图B〕，在其向前爬行时，迅速用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤〔见图C〕，将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可〔见图D〕。D图2-3小鼠的抓取2．大鼠的抓取方法大鼠的抓取根本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情凶猛，不易用袭击方法抓取。为防止咬伤，可带上帆布或棉纱手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中，这样右手可进行各种实验操作。AB图2-4大鼠的抓取3．豚鼠的抓取方法豚鼠胆小易惊，在抓取时要稳、准、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，抓住其肩胛上方，以拇指和食指环握颈部〔见图A〕，另一只手托住臀部即可〔见图B〕。AB图2-5豚鼠的抓取4．兔的抓取方法用右手抓住兔颈部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，让其体重的大局部重量集中在左手上。注意不要抓取双耳或抓提腹部。图2-6兔的抓取(四)实验动物称重、编号、标记方法1．称重大、小鼠秤的感应量需在0．1g以下。根据实验的不同要求，选择一定数量的大、小鼠，体重要求在同一组内、同性别动物体重差异应小于平均体重的10％，不同组间同性别动物体重均值差异应小于5％。2．编号动物编号方法有多种。大、小鼠常用方法如下：(1)染色法：染色法是用化学剂在动物身体明显部位如皮毛、四肢等处进行涂染，或用不同颜色等来区别各组动物，是实验室最常用、最容易掌握的方法。常用的标记液有苦味酸酒精饱和溶液〔黄色〕。标记时，用标记笔取上述溶液，在动物体表不同部位涂上斑点，以示不同号码。一般把涂在右前肢上的记为1号，按顺时针方向，依次右后肢为2号，左后肢为3号，左前肢为4号，头部为5号(见图2-7A)，6-10那么由以上5个根本数复合而成，比方6号那么是在头部和右前肢标记各一(见图2-7B)，7号为在头部和右后肢体标记一，以此类推。在动物的背部划一长条为10号。10号以上均由上述复合方法进行编号。例如：16号是在头部、右前肢、背部均有标记(见图2-7C)。图2-7A图2-7B图2-7C(2)剪耳法：在耳朵不同部位剪一小孔代表某个号码。常以右耳代表个位，左耳代表十位。或与染色法配合使用，右耳剪孔代表十位。图2-8小动物剪耳法标记号码(3)烙印法：是用刺数钳在动物耳上刺上号码，然后用棉签蘸着溶在酒精中的黑墨在刺号上加以涂抹，烙印前最好对烙印部位预先用酒精消毒。(4)号牌法：用金属的牌号固定于实验动物的耳上，大动物可系于颈上。(五)实验动物的分组方法为了得到客观的剂量—反响关系，应将一群动物按统计学原那么随机分配到各个实验组中。可按随数字表方法进行随机分组〔见随机数字表方法分组说明〕。但小动物的年龄和体重呈正相关，而年龄又与毒物代谢动力学密切相关。为了减少实验各组动物间的体重差异，在实际工作中常采用体重均衡法〔简化分层随机法〕进行分组，即将同一性别的动物按体重大小顺序排列，分组时由体重小的到大的，依次随机分配到各组。一种性别的动物分完以后，再分配另一种性别的动物。各组雌雄性动物的数目应尽可能相等。体重均衡法分配方法如下：第一步将动物按体重分组以急性毒性实验时使用小鼠为例，一般按照18～g，19～g，20～g，21～g，22～g，23～g，24～g分为7组，所有动物称重后放入相应的体重组中。第二步将同一体重段的动物均匀分配至各试验组中从最低体重组中随意取出一只动物放入实验组第一组，第二只动物放入第二组，以此类推，直到该组动物用完。再从下一体重组中随意取出动物，依次放入各实验组直至实验各组均得到一只动物。如此反复循环操作，将所有动物分完为止，结果会使体重相近的动物被均匀分布到各实验组中。随机数字表方法分组说明：例如：设将30只雄性动物平均分成A、B、C、D、E、F六组，每组5只动物。将巳编号的动物以号码按随机数字表进行分配。如选随机数字表第二行，从第一个数字开始，顺次抄下30个数字〔可依横行、竖行或斜行抄录〕。将每个数字一律除以6〔组数〕，根据余数1、2、3、4、5、0〔整除者〕分别将动物分配到A、B、C、D、E、F组，结果见表1〔数字源见第二行驶随机数字表〕表2-1动物随机分组表动物号123456789101112131415随机数字977424676242811457204253323732除6余数120120323205212分组ABFABFCBCBFEBAB动物号161718192021222324252627282930随机数字2773675124517989731676622766除6余数310130315144230分组CAFACFCAEADDBCF按上法分组后，A组有动物7只，B组7只，C组6只，D组与E组各2只，F组6只。为了使每组动物数均为5只，需要根据随机分配的原那么再选出2只A组和1只C组动物给D组。B组选出2只，F组选出1只给E组。具体方法如下：继续抄下随机数字分别除以A、B、C、F组的动物数，既56/7〔7为A组动物数〕整除，余数为0，将A组第7只动物〔25号〕调配给D组；下一个：50/6〔6为A组动物数〕余2，将A组第2只动物〔4号〕调配给D组；接下来26/6〔6为C组动物数〕余2，将C组第2只动物〔9号〕给D组。余类推，最后调整分组成表2所示。雌性动物也按上法分组，然后将雌、雄动物合组进行试验。表2-230只动物随机分组组别鼠号组别鼠号A1，14，17，19，23B5，8，10，13，15C7，16，20，22，29D4，9，25，26，27E2，6，12，24，28F3，11，18，21，30附表：随机数字表(六)实验动物被毛去除方法方法有三种：剪毛、拔毛和脱毛。1．剪毛固定动物后，用粗剪刀剪去所需部位的被毛。应注意以下几点：①把剪刀贴紧皮肤剪，不可用手提起被毛，以免剪破皮肤；②依次剪毛，不要乱剪；③剪下来的被毛集中在一个容器内，勿遗留在手术野和操作台周围。2．拔毛多用于兔耳缘静脉注射或取血时，以及给大、小鼠作尾静脉注射时，需用拇指、食指将局部被毛拔去，以利操作。3．脱毛脱毛系指用化学药品脱去动物的被毛，适用于无菌手术野的准备以及观察动物局部皮肤血液循环和病理变化。常用硫化钡或依据脱毛剂配方配制脱毛剂。(七)实验动物染毒途径和方法毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人在接触该受试物的方式。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。不同途径的吸收速率，一般是：静脉注射＞吸入＞肌肉注射＞腹腔注射＞皮下注射＞经口＞皮内注射＞其他途径(如经皮等)。毒理学那么主要采用经口(胃肠道)染毒常用有灌胃、喂饲和吞咽胶囊等方式。(1)灌胃：将受试物配制成溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内。一般灌胃深度从口至剑突下，最好是利用等容量灌胃法，即受试物配制成不同浓度，实验动物单位体重的灌胃容量相同。大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小时(因小鼠消化吸收和代谢速度较快)，均不停饮水。灌胃后2～4小时提供饲料。经口屡次染毒，一般不禁食，但应每日定时染毒。灌胃法优点是剂量准确，缺点是工作量大，并有伤及食道或误入气管的可能。灌胃针与灌胃方法：×L50mm×L70mm〕图2-10小鼠灌胃法图2-11大鼠灌胃法(2)吞咽胶囊：将一定剂量的受试物装入胶囊中，放至狗的舌后部，迫使动物咽下，此法剂量准确，适用于易挥发、易水解和有异味的受试物。(3)喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入。饲料中掺入受试物不应超过5％，以免造成饲料营养成分改变而影响实验动物的生长发育。喂饲法符合人类接触受试物的实际情况，但缺点多，如适口性差的受试物，实验动物拒食；易挥发或易水解的受试物不适用。而且，实验动物应单笼喂饲，以食物消耗量计算其实际染毒剂量。(八)实验动物生物材料采集和制备1．动物常用采血方法(1)大、小鼠鼠尾采血方法：适用于需血量少的实验。方法：将动物固定后，把鼠尾浸入45～50℃温水中使尾静脉充血，擦干皮肤后，再用酒精棉球擦拭消毒。剪去尾尖(约0．2~)，拭去第一滴血，用血色素吸管(根据需要事先在吸管内参加与不加抗凝剂)吸取一定量尾血，然后用于棉球压迫止血。也可以不剪尾，以lml注射器连上7～8号针头直接刺破尾静脉进行定量采血。(2)眼眶静脉丛采血法：操作者以左手拇指、食指紧紧握住大鼠或小鼠颈部压迫颈部两侧使眶后静脉丛充血(注意用力要恰当，以防止动物窒息死亡)，右手持玻璃毛细管从一侧眼内眦部以45角刺入，捻转前进。如无阻力继续刺人，有阻力就抽出玻璃毛细管调整方向后再刺入，直至出血为止。右手持容器收集血液后，拔出毛细管，用干棉球压迫止血。图2-12小鼠眶静脉丛〔窦〕采血(3)腹主动脉或股动(静)脉采血法：为一次性采血方法。大、小鼠麻醉后，仰卧位固定动物，剪开腹腔，剥离暴露腹主动脉或暴露股动(静)脉，用注射器刺人采血.(4)断头采血法：该法可用于大、小鼠。操作者左手握住动物，右手持剪刀，快速剪断头颈部，倒立动物将血液滴入容器。注意防止剪断的毛发掉入接血容器中。也可用大鼠断头器断头后，倒立动物接血。(5)家兔耳缘静脉采血法：家兔在兔盒中固定，拔掉一侧耳缘部细毛，轻轻以手指弹耳，使耳缘静脉充血，酒精消毒。左手压迫耳根，右手持针刺破静脉收集血液；或直接用注射器进针，耳缘静脉采血。(6)心脏采血法：将兔或大、小鼠以仰卧位固定，家兔需在左侧胸3—4肋部位剪毛，常规消毒。于第3～4肋间近胸骨左缘处，手触心搏最强部位进针,采血。采血毕迅速拔针，用酒精棉球压迫止血。大、小鼠那么在手触心搏最明显处进针。实验动物每次(日)采血量不可过多，最大平安采血量见表2-1。表2-3实验动物平安采血量动物品种最大平安采血量(1ml)最小致死采血量(ml)大鼠2．动物尿液的收集收集大动物与小动物的尿液，一般使用不同类型的代谢笼。代谢笼主要由备有动物饮水和装饲料的笼体、粪尿别离器和收集尿液容器组成。一般笼体为金属与铁丝制成，如实验要求防止金属污染时，那么代谢笼应用玻璃或有机玻璃制作。兔、狗等大动物也可用导尿法收集尿液。为了使收集的实验动物尿液满足试验需要，可在收尿前给动物一定量的水，如大鼠可先行灌胃1～5ml水或腹腔注射生理盐水.(九)实验动物的处死方法：1．颈椎脱臼法左手按住鼠头，右手抓住鼠尾猛力向后拉，使动物颈椎拉断脱节而立即死亡。此法多用于处死小鼠。2．断头法操作者用右手按住大鼠或小鼠头部，左手握住背部，露出颈部，助手用大剪刀或断头器剪断颈部使之死亡。也可使用断头器。3．击打法右手抓住鼠尾，提起，用力摔打其头部；鼠痉挛后立即死亡。也可用小木锤或器具猛力击打动物头部，使其立即死亡，常用于处死家兔或大鼠。4．麻醉致死法在密闭容器中预先放入麻醉剂(氯仿或乙醚)，然后将动物放入，密封盖好，使动物吸人过量麻醉剂致死。5．麻醉后急性放血法该法多用于处死大鼠。先腹腔注射麻醉动物后，固定动物于仰卧位，左手持镊子提起大腿内侧皮肤，右手用剪刀作一切口并向腹股沟方向剪开皮肤，皮肤切口长约3—4cm。用镊子别离筋膜，于腹股沟中点大腿内侧深部，暴露股动脉和静脉，用剪子剪断股动脉即有大量血液流出，动物迅速死亡。6．空气栓塞法用注射器向动物静脉内迅速注入一定量的空气，使之形成气栓栓塞血管，引起循环障碍致死。该法适用于大动物，如兔、狗、猴等。使用时注意需注入足够量的空气。7．化学药物致死法此法适用于较大动物如兔或狗等。方法是给动物静脉注射化学药物而致死。常用10％KCI或10％甲醛溶液进行静脉注射。8．开放性气胸法将动物开胸，造成开放性气胸，此耐胸膜腔的压力与大气压力相等，肺脏因受大气压缩发生萎缩、纵隔摆动使动物窒息而死。实验三灭多威经口急性毒性试验一、目的化学毒物经口急性毒性试验是研究化学物毒性效应的根本试验。本次实习的目的是学习急性毒性试验的实验设计原那么，学会动物分组方法，掌握经口灌胃技术和中毒病症的观察。二、原理选择健康的实验动物，根据体重按随机分组的方法，依据LD50计算的设计原那么将动物分成数个染毒组。一次或24h内屡次给予受试物后，了解动物所产生的急性毒性反响及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试物毒性反响与剂量的关系，求出半数致死剂量(LD50)，并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。三、内容1．健康小鼠的选择，性别的识别。2．称重、编号和随机分组方法。3．受试化学物溶液的配制。4．小鼠经口灌胃操作技术。5．毒性体征的观察、LD50计算和毒性分级。四、材料和试剂1．实验动物健康成年昆明小鼠60只，体重22g1000g)、灌胃针(小鼠用)、注射器(1ml)、刻度吸管(0.5、1.0、2.0、5.0、10.0m1)、容量瓶(10m1)、烧杯(10、250m1)、滴管、编号笔、小瓷盘、动物笼。3．试剂受试物：灭多威〔工业品，含量40%〕，苦味酸酒精饱和液。五、操作步骤〔一〕健康小鼠的选择〔见实习二〕，本次实验提供健康小鼠。〔二〕性别识别〔见实习二〕〔三〕小鼠称重、编号与分组：1．称重称量小鼠体重的秤，其感应量需在以下，并经过校正。称量时注意轻抓轻放，防止激惹小鼠，等小鼠安静后记录体重读数，以g表示。2．编号染色法编号〔见实习二〕3．分组体重均衡法分组〔见实习二〕〔四〕剂量设计本实验设6个剂量组，设计方案如下：组别123456剂量〔mg/kg〕100灌胃液浓度〔mg/ml〕51.64〔五〕受试物的配制实验给药的剂型,可视毒物的溶解性能,采用水溶液、混悬液、油剂或乳剂。本次实验用水溶液。非吸入染毒实验，各剂量组多按单位体重给予等容量药液的方法给药，故需先确定单位体重给药容量〔小鼠灌胃通常用0.1～0.2m1/10g体重〕,然后按实验设计的最大剂组药液浓度,计算配制所需的毒物量,配成第Ⅰ号药液,再按设计的组距,逐组稀释,配制出所需组数的药液。1．灭多威灌胃液的配制，按照上述设计的6个剂量组：最大剂量组为100mg/kg体重〔1mg/10g〕设给药容量为m1/10g体重那么药液浓度应为1mg/m1〔5mg/ml〕。配制100m1药液需受试物的量为:5mg/m1x100m1=500mg准确称取灭多威500mg，用少量蒸馏水溶解后，移入100m1容量瓶，然后加蒸馏水稀释至刻度，此溶液浓度为5mg/ml〔实验教师已配好〕。余下各组需学生自行配制。〔六〕灌胃操作小鼠灌胃法〔见实习二实验动物的染毒途径和方法〕：采用专用小鼠灌胃针，安装在1ml的注射器上，吸取所需的灭多威溶液，左手抓住小鼠的双耳后、颈部的皮肤，用无名指、小手指和大鱼际肌将其尾根部压紧，将小鼠固定成垂直体位，腹部面向操作者。注意使动物的上消化道固定成一直线。右手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。假设遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可深入至胃部。如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免穿破食管，甚至误入气管，导致动物立即死亡。注意要点：①小鼠一定要固定好。②头部和颈部保持平展。③进针方向正确。④一定要沿着口角进针，再顺着食管方向插入胃内；⑤决不可进针不顺就硬向里插。一般进针深度小鼠2.5～4cm，大鼠或豚鼠4～6cm。为了验明是否已正确地插入胃部，可轻轻回抽注射器，如无气泡抽出，说明已插入胃中；如有大量气泡，那么提示误插气管，应抽出重插。随后将受试物溶液注入。灌胃容量小鼠通常为0.2～1ml，大鼠1～4ml，豚鼠1～5ml。〔七〕中毒体征和动物死亡情况观察和LD50计算1．中毒病症染毒后注意观察毒性体征和死亡情况。高剂量组动物的死亡常很快发生，染毒后应即刻密切观察。观察和记录中毒体征及出现的时间、死亡数量和时间及死亡前的特征。根据观察情况分析中毒特点和毒作用靶器官。按照实验结果，填写急性毒性实验记录表。染毒时间2小时。表3-1急性毒性实验原始记录受试物名称：动物种属品系：性别：动物来源及合格证号：染毒途径：剂量组别：室温：日期:动物编号体重〔g〕灌胃量〔ml〕体征及出现时间震颤抽搐流涎针尖样瞳孔管状尾侧卧腹式呼吸死亡12345实验操实验记录者：2．LD50计算采用改良寇氏法求出LD50及95％的可信限范围，计算方法见附录。六、结果评定根据小鼠中毒体征、死亡时间和特征、LD50，参照农药急性毒性分级〔见表3-2经口LD50〕进行评定，判断该受试物的毒性大小及毒性特征。表3-2农药的急性毒性分级[经口LD50〔mg/kg〕]毒性分级剧毒高毒中等毒低毒mg/kg〈55～50～500〉500(引自:张桥主编的卫生毒理根底卫生毒理学实验方法.北京:人民卫生出版社.2001,215)七、考前须知１．注意自我保护。２．灌胃前，各组受试物溶液均应充分混匀。３．灌胃时，推进速度不能太快或太慢，以免动物将药液呕出或因挣扎而伤害上消化道的粘膜。４．应选用针尖圆纯的灌胃针头进行灌胃。5．中毒死亡及脱臼处死的小鼠，装进塑料袋〔注意不要夹带任何杂物放进塑料袋〕，送到801室集中放到专用纺织袋置于冰柜冷冻贮存待销毁。6．按规定方法销毁剩余受试物。八、实验报告实验报告应包括以下内容：1．实验动物的种属、品系、性别及来源。实验前动物禁食和健康状况。2．实验动物体重和随机分组情况。3．受试物的名称、来源、纯度、性状等情况。4．受试物的配制和溶媒。5．详细描述实验观察的中毒表现和死亡情况等(表1)。6．LD50的计算方法和结果。7．受试物的毒性分级、分级依据和结果评价。九、附录LD50(LC50)计算方法:改良寇氏法改良寇氏法是利用对数与死亡率呈S型曲线而设计的方法,又称Karber法或平均致死量法。该法计算简便，准确率高，是较为常用的方法。本法要求每个染毒剂量组动物数要相同，各剂量组组距呈等比级数，死亡率呈正态分布，最低剂量组死亡率呈<20％，最高剂量组死亡率>80%。计算公式如下：式中：:lgLD50:相邻两剂量组之间之对数剂量差值；:最大剂量的对数值；:存活率〔q＝1-p〕；：各剂量组死亡率总和；：每组动物数。例如：小鼠经口给予某化学物质的剂量和死亡数资料见下表2。表3-3某化学物质小鼠经口染毒死亡情况组别剂量动物数〔n〕死亡数〔只〕死亡率〔p〕存活率〔q〕Mg/kg对数11002102310541075109按式计算得：lgLD50=1.4961-0.08(2.3-0.5)=lgLD50±×±所以lgLD50及95％可信区间范围为22.50mg/kg〔20.44～24.76mg/kg〕。实验四苯经呼吸道急性毒性试验一．目的经呼吸道急性毒性试验是卫生毒理学的重要根本实验技术之一。外源性化学物经呼吸道吸人是工业毒理学和环境毒理学中最常见的接触途径之一，也是药品和农药的接触途径之一。常用于研究气态、蒸气态、气溶胶、烟尘、粉尘状的外源性化学物对呼吸道损伤、吸收后对机体损害。可求出吸人接触的半数致死浓度(LC50)，并进行急性毒性分级。本实习的目的是学习静式呼吸道染毒技术，掌握LC50的实验步骤和方法。二．原理呼吸道吸人染毒可分为两种方式，一是动式吸入，一是静式吸人。其类型又可分为两种，一是将实验动物整体置于染毒柜中；一是只将实验动物的口鼻部位与染毒柜中含受试物的空气接触，身体其他部位置于染毒柜外，也称为面罩吸人染毒。静式吸入染毒系将实验动物置于一个一定的体积的密闭容器内，参加定量的易挥发液态受试化合物或一定体积的气态受试化合物，在容器内形成所需的受试化合物的空气环境。接触一定时间〔一般为2h或4h〕后，观察动物的中毒反响，并根据动物的死亡情况和相应的受试物浓度，求出LC50。这种接触方式，染毒柜的体积与所放置的动物数量应相适应，否那么会出现缺氧与二氧化碳潴留现象。一般要求在接触期内染毒柜的氧分压不能低于19%，二氧化碳分压不能超过1.7%。染毒柜体积、放置动物种类和数量及放置时间相互关系见表3。表4-1实验动物的最低需气量及不同染毒柜容积应放置的动物数〔染毒2h〕动物种属呼吸通气量最低需气量不同容积染毒柜放置动物数〔只〕〔L/h〕〔L/h〕25L50L100L300L1000L家3～56～1012～1536～40120～150011～25～616～18011～25～616～180003～49～1000014～500013～400001(引自:南京医科大学公共卫生学院王心如主编.毒理学实验方法与技术.北京:人民卫生出版社.2005,15)染毒柜：有机玻璃制成，现有容积有60L和100L两种规格。柜顶盖部有三个附件。一个是投药孔，一个是用于混匀蒸气或气体的小电扇，一个是插入温度计的孔。在柜壁上挂有一个小不锈钢碟为接受和蒸发液态受试物的药物蒸发器。〔见以下图〕图4-1有机玻璃静式染毒柜三．内容1．静式呼吸道吸人染毒操作。2．毒性体征的观察和LC50计算。四．试剂和材料〔一〕实验动物健康成年昆明小鼠60只，体重22-24g，雌雄各半。〔二〕器材静式吸入染毒柜有60L和100L)两种规格、动物称(电子天平，感应量0.1/1000g)、刻度吸管(0．2、0．5、1．0、5．〔三〕试剂1．受试物：苯〔分析纯〕、d=0.878g/ml。2．苦味酸酒精饱和液。五．操作步骤1．小鼠称重、编号与分组〔见实习二〕。2．剂量设计设6各剂量组，具体方案如下：组别123456剂量〔mg/L〕115静式染毒多采用计算方法折算染毒柜内受试化合物的浓度,易挥发液体化合物浓度计算式为:式中:C实验设计受试化合物的浓度(mg/L);a应参加受试化合物的量(ml);d受试化合物的比重(g/ml);L染毒柜体积(L)3．呼吸道吸人染毒将已称重、编号的小鼠放入染毒柜内，加盖时注意蓝色小盖帽〔为加药孔〕对准挂在柜臂的小不锈钢碟〔接物蒸发器〕并扣紧，根据设计的剂量浓度及染毒柜体积，计算出应参加苯溶液的量，用刻度吸管吸取苯溶液并经加药孔加到不锈钢碟上，接通电源小电扇开启，计时。观察、记录中毒体征和动物死亡情况，按表填写〔参照实习三的表1〕。染毒时间2小时。4．LC50计算参照实习三LD50计算方法进行计算。六．结果评定依据小鼠中毒体征、死亡时间、LC50，参考相应的急性毒性分级标准，判断该受试物的毒性大小及其毒性特征。表4-2化学物质急性毒性分级〔小鼠一次吸入2小时LC50〕毒性分级剧毒高毒中等毒低毒g/ml<0.50.5～<5.05.0～<50〉50七．实验报告见经口急性毒性试验实习要求。八．考前须知1．注意染毒柜密闭，保持柜内受试物浓度，防止污染周围环境和影响操作者。2．染毒结束，应在启动的通风柜内开启染毒柜，待20分钟后取出小鼠，活的脱臼处死。3.中毒死亡及脱臼处死的小鼠，装进塑料袋〔注意不要夹带任何杂物放进塑料袋〕，集中送到801室,置于冰柜专用纺织袋冷冻贮存待销毁。实验五蓄积毒性试验一、目的蓄积毒性试验是评价外源化学物有无蓄积毒性的重要方法。本实习的目的是了解蓄积毒性试验的原理，掌握蓄积系数法。二、原理某些毒物屡次以小剂量反复进入体内，可表现出机体对该毒物的反响性增强，即一次染毒不引起反响的剂量，如屡次重复染毒，那么可能引起明显的反响甚至死亡。这说明毒物有蓄积毒性。毒物的蓄积与进入机体的毒物剂量、重复染毒间隔时间、毒物的毒性及其代谢特点和机体反响特性条件有关。三、试剂和材料1．实验动物健康成年大鼠或小鼠。2．器材注射器、灌胃针、动物体重秤。四、实验方法采用蓄积系数法：选用大鼠或小鼠以经口灌胃或腹腔注射方法进行试验，先进行受试物的急性毒性试验，求出LD50。然后选取相同条件的动物40只(或更多)，随机分为试验和对照2组，每组至少20只，雌雄各半。在1/20～1/5LD50范围内选择剂量，以相同染毒途径、定时、定量对试验组染毒。观察记录动物死亡数。当试验组累积发生一半动物死亡时终止染毒。累计自实验开始到出现50％动物死亡时的累积染毒总剂量(∑LD50[n])，用公式1计算该毒物的蓄积系数K值：蓄积系数K=∑LD50[n]/∑LD50[1](公式1)式中∑LD50[1]：一次染毒的50％的致死剂量；∑LD50[n]：引起动物死亡的累计总剂量。根据蓄积系数值，可将毒物的蓄积作用分4级(表5—1)。∑LDs。剂量，然后染毒剂量按1.5倍每4天递增一次，染毒剂量安排见表5—2。表5—1按蓄积系数对蓄积作用分级蓄积系数分级0～极强蓄积1～强蓄积3～中等蓄积5～弱蓄积表6—2蓄积试验染毒方案接触天数〔天〕1～45～89～1213～1617～2021～2425～28每日接触剂量〔LD504日接触总剂量(LD50累积接触总剂量〔LD50蓄积系数的计算仍用公式1，评价的标准仍按表6—1。实验六亚慢性和慢性毒性试验一、亚慢性毒性试验(一)目的化学毒物的亚慢性毒性试验是毒理学中重要的根本技术之一，是研究化学物毒性效应的根本试验。亚慢性毒性试验是在急性毒性试验的根底上，进一步研究屡次重复染毒条件下出现的中毒体征和生化病理改变以及可能的靶器官，确定是否需要进行慢性试验，并为慢性试验设计提供依据。本实验目的为掌握亚慢性毒性试验的设计原那么和主要步骤。(二)试剂和材料1．实验动物健康大鼠或小鼠80只以上．非啮齿类可选用犬。2．器材注射器、灌胃针、电子天平、动物体重秤、血液生化仪、血细胞计数仪、病理检查设备、显微镜等。(三)操作步骤1．实验动物及分组选用健康年幼的动物，小鼠体重为16～18g，大鼠重80～lOOg。各试验组动物体重均值应相近，各动物体重不应超过组平均体重的20％。大白鼠或小白鼠，各组不少于20只。雌雄各半。至少设3个剂量组和1个对照组。2．染毒剂量及实验期限参考急性毒性LD50来设计剂量。高剂量能引起动物明显中毒反响或少数动物死亡(死亡率应低于10％)，低剂量不引起任何中毒反响。实验期的长短可根据实验目的和要求来确定，一般为1～6个月。3．染毒途径根据实验目的和毒物性质的不同，选择不同的染毒途径。如口服药物的研究常采用经口灌胃染毒法；食品毒理研究(农药和食品添加剂)常用经口喂饲染毒法；工业毒理研究(气体和挥发性液体)常用呼吸道染毒法。一些可经皮吸收的毒物，也可用经皮染毒的方法。(1)喂饲法：将无异色、臭味的毒物均匀地拌人饲料中，让动物自由摄食。大鼠饲料时食量按体重的10％折算。注意扣除动物弄撒在笼底的饲料量(包括毒物)。(2)饮水法：将水溶性的无异味的毒物溶于饮水中，让动物自由饮用。(3)灌胃法：对于给药量要求准确度较高和不宜混在饲料或水中的毒物，可以配成溶液(或混悬液)，采用经口灌胃的方法。经口灌胃方法的给药量较准确，故常被采用。(4)吸人法：对于气体或挥发性液体毒物，应采用呼吸道吸人染毒的方法。(5)经皮染毒：某些可经皮肤吸收的毒物可用重复涂抹皮肤的方法。4．观察指标(1)一般综合指标：观察动物的一般行为、体重摄食量变化、中毒体征和死亡情况。每周称体重一次，记录摄食量，计算食物利用率。(2)血液及生化检验：常规工程包括血红蛋白、红细胞数、白细胞数、血小板数、网织红细胞数、血清酶活力(谷丙转氨酶、磷酸酶)、血清蛋白、尿素氮、非蛋白氮、肌酐含量等此外，还应根据毒物作用特点选择其他指标。(3)脏器重量：计算脏器系数，即某个脏器的湿重与单位体重的比值。一般实质性脏器如心、肝、脾、肺、肾等均应计算其脏器系数。(4)病理学检查实验结束时，处死所有动物进行大体尸检。如未见明显病变，可将高剂量组和对照组的主要脏器进行病理学检查，发现病变后再对较低剂量组相应器官组织进行检查，特别要注意肝、肾、睾丸等器官。实验过程中死亡或濒死的动物亦应进行组织病理学检查。(四)评价由实验结果应得出未观察到有害作用的剂量(NOAEL)和观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)，主要中毒体征和毒作用的靶器官，为慢性实验提供资料。二、慢性毒性试验(一)试验目的经过长期、反复给予实验动物不同剂量的受试物后，观察慢性毒性效应、严重程度、靶器官和损害的可逆性。确定NOAEL和LOAEL，为制定人类接触该受试物的平安限值提供科学依据。本试验通常为毒理学平安性评价的最后阶段，试验的周期长，人力、物力、财力消耗大，影响因素多，其结果常可决定受试物的取舍。故要严格遵守良好实验室标准(GLP)和标准操作程序(SOP)进行，以保证试验的科学性与可靠性。(二)试剂和材料1．实验动物健康初断乳大鼠160～400只，亦可选用犬等。2．器材和试剂同亚慢性毒性实验。(三)操作步骤1．实验动物及分组分组设3～4个剂量组和，1个对照组，大鼠每组40～100只；犬8～12只；雌雄各半。其他要求根本同亚慢性实验。2．染毒剂量和实验期限