NY∕T 551-2017 鸡产蛋下降综合征诊断技术

鸡产蛋下降综合征诊断技术2017-06-12发布中华人民共和国农业部发布 I鸡产蛋下降综合征诊断技术本标准规定了产蛋下降综合征的临床诊断和实验室诊断(病毒分离、血凝和血凝抑制试验及PCR下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法4.1.1鸡群在产蛋高峰期(27周龄～49周龄)产蛋下降15%~50%,一般持续4周~10周产蛋逐渐恢4.1.2鸡蛋破损率5%～20%。鸡群出现4.1中任何一种临床症状和/或剖检出现4.2中的病理变化，可判定为疑似产蛋下降综合15.1.1试剂磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/L,pH7.2),配制方法见附录A的A.1。5.1.2样品的采集和处理按照NY/T541的规定进行样品采集，选择下列1种或2种样品：a)扑杀疑似EDSV感染鸡，取适量输卵管和卵泡膜样品，研磨。加PBS制成1:5混悬液后冻融3次，3000g离心10min,取上清，加入青霉素(终浓度为1000IU/mL)和链霉素(终浓度为b)采集劣质蛋清，加等量PBS,并加入青霉素(终浓度为1000IU/mL)和链霉素(终浓度为1000μg/mL),37℃作用1h,5.1.3鸭胚接种及尿囊液收获0.2mL样品(5.1.2)经尿囊腔接种鸭瓜，另设接种PBS的鸭胚做对照，37℃孵育。弃掉48h内死亡的鸭胚，收获48h～120h死亡和存洁的鸭胚尿囊液。5.2分离物血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验鉴定5.2.1.2.1EDSV标准抗原。5.2.1.2.2磷酸盐缓忡液(PBS,0.01mol/L,pH7.2),配制方法见A.2。5.2.1.2.31%鸡红细胞悬液，配制方法见附录B。5.2.1.3血凝试验操作步骤5.2.1.3.1取96孔上型反立板，用做量移液器在1孔～12孔每孔加PPS5.2.1.3.2吸取25C准书原或者传检尿零液的能悬液加入第1孔中，吹打次～次，充分混匀。入到第3孔，依次进行系列合比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取25山弃之，设第12孔为PBS对照。5.2.1.3.4每孔再加25LPBS。5.2.1.3.6振荡混匀反应混合液。20℃~25℃下静置40min后观察结果，或4℃静置60min,PBS对照孔的红细胞呈明显的纽扣状沉到孔底时判定结果。5.2.1.4结果判定结果判定细则如下：a)在PBS对照孔出现红细胞完全沉淀的情况下，将反应板倾斜，观察各检测孔红细胞的凝集情况。以红细胞完全凝集的病毒尿囊液最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度，以使红细胞完全凝集的病毒尿囊液的最高稀释倍数为1个血凝单位(HAU)。b)如果尿囊液没有血凝活性或血凝效价小于4log2,则用初代分离的尿囊液在SPF鸭胚或非免疫鸭胚中继续传代两代。若血凝试验检测仍为阴性，则判定产蛋下降综合征病毒分离结果为阴性。c)对于血凝试验呈阳性的样品，应采用EDSV标准阳性血清进一步做血凝抑制试验，并与NDV2和AIV阳性血清(H7亚型和H9亚型AIV阳性血清)进行鉴别诊断。5.2.2血凝抑制试验5.2.2.1材料5.2.2.1.196孔V型微量反应板。5.2.2.1.2微量移液器。5.2.2.2.3其他阳性血清：新城疫病毒(NDV)阳性血清，禽流感病毒(AIV)阳性血清(H7亚型和H95.2.2.34个血凝单位(4AU)的EDSY杭原制备根据5.2.1测定的病毒尿液的耳A效价，推定AHAU犹原的稀释倍数配制抗原工作浓度。按下列方法计算，如尿囊液中病毒抗原的自A效价为910g2,其/AU为71og2,则舟尿囊液稀释128倍即5.2.2.4血凝抑制试验操作步骤5.2.2.4.2根据血费式验结果配制4HAU抗原(见5.2.2.3)。5.2.2.4.3取96孔V型做最反应板，用移液器在第1孔～第11孔各加大25tLPEs,第12孔加入505.2.2.4.4在第1孔加不25ALEDSV标准阳让而清，充分混匀后移出25书2孔，倍比稀释至第室温下(20℃~25℃)靛的不多于n,4℃不少子60min。5.2.2.4.6每孔加人25的1%对红细胞悬液，轻晃混匀后，室温(20℃)静置40min,或4℃静置60min。当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果。5.2.2.5与新城疫和禽流感鉴别诊断应以NDV和AIV阳性血清对分离物做鉴别诊断，用NDV阳性血清和/或AIV阳性血清代替EDSV标准阳性血清，进行血凝抑制试验(见5.2.2.4)。NDV阳性血清和AIV阳性血清应不能对分离物产生血凝抑制，表1中示例结果表示EDSV分离结果阳性。表1应用血凝抑制试验鉴定分离物H⁷亚型AIV阳性血清十十3全不凝集(红细胞完全流下)的阳性血清最高稀释倍数。当阴性血清对标准抗原的HI滴度不大于2log2,阳性血清对标准抗原的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内，并且所用b)尿囊液血凝效价≥4log2,且EDSV标准阳性血清对其血凝抑制效价≥4log2时判产蛋下降综5.3.1.1去离子水(dH₂O)按照GB/T6682的规定制备。5.3.1.2PCR扩增用DNA聚合酶(商品化试剂)。5.3.2仪器5.3.2.3小型离心机样品的采集和处理选择下列1种或2种：a)取接种样品后48h～120h死亡或存活的鸭胚尿囊液于微量离心管中，3000g离心5min,取DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书方法提取上述a)和/或b)样品病毒基因组以及阳性对EPF:5'-TAATTTTCTCGGGACTTTCG-3'(上游引物);表2PCR反应体系配置表5.3.4.4设EDSV基因组为阳性对照，阴性尿囊液提取的DNA为阴性对照，平行加样，体系同4标准分享吧5.3.4.6PCR反应结束后，PCR反应管在电泳鉴定前可置2℃~8℃冰箱中保存。5.3.5.1配制1×TAE缓冲液(见A.3.2),制备2%琼脂糖凝胶(见A.3)。5.3.5.2取10μLPCR产物EDSV阳性对照应有大小约0.43kb(431符合5.3.6.1条件：临床诊断符合第4章中规定的临床症状和病理变化，5.2和/或5.3试验为阳性结果，可判定为产561%鸡红细胞悬液制备采集至少3只SPF公鸡或无产蛋下降综合征病毒、禽流感病毒和新城疫病毒抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入3倍～4倍体积的PBS混匀，以2000r/min离心5min～10min。去掉血成体积分数为1