(高清版)GBT 40980-2021 生化制品中还原糖的测定 柱前衍生高效液相色谱法

生化制品中还原糖的测定柱前衍生高效液相色谱法2021-11-26发布国家标准化管理委员会I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。本文件起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、深圳市分析测试协会、甘肃中商食品质量检验检测有限公司、西华大学、电子科技大学、青岛科技大学、中国测试技术研究院。1生化制品中还原糖的测定柱前衍生高效液相色谱法本文件规定了采用柱前衍生高效液相色谱法测定生化制品中D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-半乳乳糖10种还原糖的测定方法。本文件适用于含糖胃蛋白酶、静脉注射用人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、改良Y培养基、葡2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理样品中的还原糖经沸水提取，提取液与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)在碱性条件下反应，生成糖衍生物，经液相色谱分离紫外检测器测定，色谱保留时间定性、外标法定量。5试剂或材料除特殊说明外，本方法所用试剂除流动相为色谱纯外均为分析纯，试验用水均为GB/T6682规定的一级水。5.1磷酸二氢钾(KH₂PO₄)。5.2氢氧化钠(NaOH)。5.3亚铁氰化钾[K₄Fe(CN);·3H₂O]。5.4乙酸锌[Zn(CH₃COO)₂·2H₂O]。5.51-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(C₀H₀N₂O,PMP)。5.6盐酸(HCl)。5.7三氯甲烷(CHCl₃)。5.9乙腈(CH₃CN):色谱纯。25.10三乙胺(C₆H₁sN)。5.11正己烷(C₆H₆)。5.12亚铁氰化钾溶液(106g/L):称取106.0g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至1000mL。5.13乙酸锌溶液(220g/L):称取220.0g乙酸锌，用水稀释至1000mL。5.140.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生溶液：称取87.1解并定容至1000mL。5.151.0mol/LNaOH溶液：称取40.0g氢氧化钠，加入水中溶解并稀释至1000mL。5.161.0mol/LHCl溶液：取83.2mL浓盐酸，缓慢加入约800mL水中，冷却后加水定容至1000mL。半乳糖(CAS:59-23-4)、L-阿拉伯醛糖(CAS:5328-37-0)、D-木糖(CAS:31178-70-8)、L-岩藻糖(CAS:均≥99%。5.18混合标准储备液：分别称取100mg标准物质(精确至0.1mg),用水溶解并定容至100mL,配制成质量浓度约为1000pg/mL的混合标准储备液，冷藏保存。标准溶液浓度系列。6.1高效液相色谱仪：配紫外检测器(UV)或二极管阵列检测器(DAD)。6.3超声波提取器：功率250W,工作频率40kHz。6.5酸度计：精度为0.01个pH单位，pH值测定范围为0～14。6.6数显恒温水浴锅：精确度到0.1℃。6.7涡旋混匀器。6.8电动粉碎机。取有代表性的样品至少50g,固体样品(液体样品混匀直接待用)用电动粉碎机粉碎(过孔径为称取样品5g(精确到0.001g)于50mL离心管中，加入20mL水，在沸水浴中提取30min,超声提取10min;样液泠却后，加入正己烷5mL,涡旋2min,于5000r/min离心5min,弃去正己烷层，将水层清液倒入50mL容量瓶中；向固体残渣中加入10mL水，涡旋2min,于5000r/min离心3min,水3层合并于上述50mL容量瓶中，加入5mL亚铁氰化钾溶液，5mL乙酸锌溶液，用水定容，混匀，离心取上清液，经0.45m滤膜过滤后待用。7.2.2含油脂及蛋白类液体样品前处理称取样品5g(精确到0.001g)于50mL离心管中，加入20mL水，在沸水浴中提取15min,超声提取10min,样液冷却后，加入3mL亚铁氰化钾溶液，3mL乙酸锌溶液，用水定容至40mL,充分振摇离心管，于5000r/min离心5min;取部分澄清水层，加入正己烷5mL,振摇或涡旋2min,于5000r/min7.2.3不含油脂及蛋白类液体样品前处理称取样品5g(精确到0.001g)于50mL离心管中，加水至40mL,在沸水浴中提取15min,超声提取10min,样液泠却后，转移至50mL容量瓶中定容，取水层清液经0.45μm滤膜过滤后待用。7.3试样衍生分别吸取试样和不同浓度的标准工作溶液0.4mL于15mL具塞试管中，加入1.0mol/LNaOH溶液0.2mL,0.5mol/LPMP衍生溶液1.0mL,在70℃恒温水浴中反应60min;冷却至室温，加入1.0mol/LHCl溶液0.2mL,摇匀后，氮气吹干；加入2mL蒸馏水复溶，再加入2mL三氯甲烷，充分涡旋后静置或离心，弃去下层有机层，重复此操作三次，取上层水相过0.45μm滤膜后进入液相色谱分析。7.4仪器色谱参考条件仪器色谱参考条件如下：a)色谱柱：C₁s色谱柱，250mm×4.6mm,3.0μm,或同等性能的色谱柱；b)流动相：A相为含20mmol/LKH₂PO₄(三乙胺调节pH值至7.8±0.1)水溶液，B相为乙腈，梯度条件见表1;d)柱温：35℃;表1梯度洗脱参考条件时间/min流量/(mL/min)07.5标准曲线的制作以标准工作溶液中目标还原糖的浓度为横坐标，以响应值为纵坐标，绘制标准工作曲线。10种还原糖标准品色谱图见附录A中图A.1。7.6样品的测定将待测样品液上机测定，记录色谱图，根据保留时间定性，记录峰面积，根据标准曲线计算待测样品4液中糖的浓度8分析结果计算与表示试样中还原糖含量按照式(1)计算：……………式中：X——样品中还原糖的含量，单位为克每一百克(g/100p——从标准工作曲线上得到的被测组分溶液质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);V——样品溶液定容体积，单位为毫升(mL);K——样品稀释倍数；m——所称试样的质量，单位为克(g)。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。9精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。本方法测定10种糖标准品的参考检出限和定量限见表2。表210种糖标准品检出限和定量限序号化合物检出限/(pg/mL)定量限/(μg/mL)2甘露糖核糖0.2340.2410.7020.7233鼠李糖0.2370.7114乳糖0.4515麦芽糖0.4546葡萄糖0.2140.642