(高清版)GBT 41522-2022 三种犬病病毒基因芯片检测方法VIP

三种犬病病毒基因芯片检测方法国家标准化管理委员会I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生物芯片标准化技术委员会(SAC/TC421)归口。本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心、博奥生物集团有限公司、北京农学院、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心。1三种犬病病毒基因芯片检测方法本文件描述了同时检测三种犬病病毒(CDV、CPV和CAV-1)的微阵列基因芯片检测方法和微流控芯片检测方法。本文件适用于待测对象鼻拭子、粪拭子、血浆、血清及脏器肌肉组织等样品中三种病毒核酸的同时2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T40458—2021用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。BSA:牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin)CAV-1:犬1型腺病毒(Canineadenovirus-1)cDNA:互补DNA(ComplementaryDeoxyribonucleicAcid)CDV:犬瘟热病毒(CanineDistempervirus)CPV:犬细小病毒(CanineParvovirus)DEPC:焦碳酸二乙酯(DiethylPyrocarbonate)DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)dNTPs:核苷三磷酸(NucleosideTriphosphate)DMSO:二甲基亚砜(DimethylSulfoxide)DTT:二硫苏糖醇(Dithiothreitol)EDTA:乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAcid)PBS:磷酸缓冲盐溶液(PhosphateBufferedSaline)PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)2RNase:核糖核酸酶(Ribonuclease)Rnasin:核糖核酸酶抑制剂(RibonucleaseInhibitor)RT-PCR:反转录-聚合酶链反应(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction)SDS:十二烷基磺酸钠(SodiumDodecylSulfate)SSC:柠檬酸钠缓冲液(CitricacdSodiumCitrateBuffer)Tris-HCL:三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(TRISHydrochloride)5原理在序列比对基础上，分别针对CDV、CPV和CAV-1保守区设计合成引物和探针。对于三种犬病病毒的微阵列基因芯片检测方法，用点样仪将长度为20nt左右的寡核苷酸探针，点制在醛基化玻璃基片上。对待检样品进行检测时，先用引物将样品中存在的病毒核酸保守区扩增出来，再通过标记PCR将荧光染料Cy-3或Cy-5标记在扩增产物上，当扩增产物与芯片杂交后，杂交位点就会发出荧光信号，通过芯片扫描仪捕获荧光信号，从而确定样品中是否含有这三种犬病病毒核酸。对于三种犬病病毒的微流控芯片检测方法，将引物分别固定在微流控芯片相应位置后，对微流控芯片进行封装，将提取的核酸模板与反应液(包含荧光物质)混合反应后，加入封装好的微流控芯片中，之后放入带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测一体化的微流控芯片检测仪中，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有目的片段，则能够得到恒温扩增，扩增产物与荧光物质进行有效的结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观反应扩增产物的产生，根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有相应的病毒核酸。6仪器与材料6.1仪器6.1.1芯片点样仪。6.1.2芯片扫描仪。6.1.3微流控芯片检测仪。6.1.5纯水仪。6.1.6芯片杂交盒。6.1.7高速微型离心机(离心速度12000r/min以上)。6.1.8台式高速离心机(离心速度3000r/min以上)。6.1.9旋涡振荡仪。6.1.10恒温干燥箱。6.1.11旋涡振荡仪。6.1.12微量点样仪。6.2试剂和耗材6.2.1总则：除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的三级水，所有试剂均用无RNase污染的容器分装。36.2.2阴性对照、阳性对照和微流控芯片内参对照的成分如下。——阳性对照：从阳性样本中提取的核酸，或人工合成的含有目标核酸序列的DNA片段。——内参对照：包括扩增内参基因片段的引物和人工合成的内参质粒，其中引物固定于微流控芯片反应孔中，内参质粒存在于反应液中。6.2.3PBS(应符合附录A的规定):121℃,15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素尿素，1%吐温-20。液三和洗脱液等。也可以使用其他等效核酸提取试剂或者将DNA或RNA分别提取的试剂。6.2.675%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水(符合GB/T6682要求)配制，—20℃预冷。6.2.7微阵列芯片检测缓冲液配制、引物、探针序列、反应液体系、杂交液体系组成、芯片制作及使用注意事项应符合附录A和附录B中表B.1～表B.3的规定。6.2.8微流控芯片反应液：20mmol/LTris-HCl(pH8.8),10mmol/LKCl,10mmol/L(NH₄)₂SO₄,6.2.9微流控芯片：5μL/反应池，8样本的离心微流控芯片。CPV、CDV和CAV-1引物应符合附录C中表C.2～表C.4的规定。微流控芯片试剂组分和存放条件应符合表C.1的规定。微流控芯片制作与质量控制相关示例见附录D。RNase离心管(1.5mL、2mL)等。7试验方法7.1样品所有测试样品的采集、保存和运输应按照GB/T27401的规定执行。7.1.2采样工具钵等。取鼻拭子和粪拭子，采集方法如下：——取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次～3次并旋转，粘取鼻腔分泌液；——取粪拭子时将拭子深入肛门旋转一圈并沾取少量粪便。将采样后的拭子分别放入盛有1.0mLPBS的1.5mL离心管中，加盖、编号。用无菌剪刀、镊子采集病死动物实质脏器和肌肉组织，装入一次性无菌样品袋或其他灭菌容器，4编号。用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中，编号备用。样品采集后，放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋),采集的样品置保温箱中，加采集或处理好的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存，应放置于一70℃冰箱，避免反复冻融(冻融不超过3次)。样品在混合器上充分混合后，用灭菌镊子将拭子中的液体挤出，3000r/min离心5min,吸取上清液1mL转入无菌的1.5mL离心管中备用。取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mLPBS混匀，取上清液1mL转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。制备的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h,若需长期保存应置一70℃以下，避免反复冻融(冻融不超过3次)。7.2核酸提取CDV属于RNA病毒，CPV和CAV-1属于DNA病毒，本文件以常规核酸提取试剂(可同时提取DNA和RNA)为例说明核酸提取步骤，也可按照GB/T40458—2021的方法提取，还可采用其他等效商品化试剂盒提取。实验前，将各试剂于室温下溶解，充分混匀并短暂离心后使用。7.2.2核酸提取纯化准备7.2.2.1裂解液如有沉淀，请于56℃温浴至沉淀完全溶解后使用。7.2.2.2使用前，加24mL无水乙醇至洗液三中，混匀，并做好标记(拧紧瓶盖，防止乙醇挥发)。7.2.2.3将蛋白酶混合物充分混匀后，按照每管20μL分装至各离心管中。7.2.3核酸提取纯化振荡10s,56℃孵育10min;2℃~8℃8000r/min离心1min,取上清待用。7.2.3.3静置离心管10min,期间每隔2min上下颠倒离心管5次，使管内磁珠分布均匀。57.2.3.4将离心管置于离心机上，2℃~8℃8000r/min离心1min,用移液器吸去管内液体。7.2.3.5加入500μL洗液一，用移液器吸头轻柔打散管壁磁珠，旋涡振荡10s,直至其分布均匀。7.2.3.6将离心管置于离心机上，2℃~8℃8000r/min离心1min,用移液器吸去管内液体。7.2.3.7加入500μL洗液二，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，旋涡振荡10s,直至其分布均匀。7.2.3.8将离心管置于离心机上，2℃~8℃8000r/min离心1min,用移液器吸去管内液体。7.2.3.9加入500μL洗液三，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，旋涡振荡10s,直至其分布均匀。系组成应符合B.3的规定，充分混匀后，盖紧管盖，500r/min离心30s,将离心后的PCR管放入PCR仪反应。循环条件设置：——第一阶段，预变性94℃5min;7.2.3.10以得到的PCR产物与基因芯片进行杂交，杂交反应体系组成应符合B.3的规定。芯片杂交盒中加入200μL去离子水，将芯片正面朝上放进杂交盒中，对准方向放入盖片，通过加样孔将变性后的杂交液取15μL一次性注入，使其充满盖片和芯片之间空隙，封闭杂交盒，42℃恒温水浴杂交2h。杂交完毕后，弃去盖片，芯片探针面向下在少量预热的2×SSC(含0.2%SDS)中漂去残余杂交液(注意避免四个矩阵的杂交液交叉污染),撕去芯片上的橡胶围栏，在预热至42℃的杂交洗液I搅拌清洗4min,继续在预热至42℃的0.2×SSC中搅拌清洗4min,2000r/min离心1min,置于暗盒室温保存。将芯片置于芯片扫描仪中进行扫描分析，Cy-3标记用532nm激光管扫描，Cy-5标记用635nm激光管扫描，光电耦合装置信号设为900。获得各点荧光强度、背景强度等数据。7.2.6微阵列芯片结果判定7.2.6.1检测结果判读原则依据以下原则判读检测结果：——每个检测点信号值=该点荧光强度值一该点背景强度值；——阴性对照平均信号值=3个阴性对照点信号值的平均值一该点背景强度值；——检测点阳性判读标准：检测点信号值一该点背景强度值>2倍阴性对照平均信号值。7.2.6.2.1阴性对照信号值接近背景强度值。7.2.6.2.2探针结合对照、杂交对照、标记对照、阳性对照信号值均为阳性。7.2.6.2.3若探针结合对照点中任何一个为阴性，则表明探针与片基结合存在问题；若杂交对照为阴性，则表明杂交环节存在问题；若标记对照为阴性，则表明标记扩增环节存在问题；若阳性对照为阴性，则表明总RNA提取环节存在问题。出现上述情况任何一种，此次实验视为无效。7.2.6.3结果描述及判定病毒的每条探针检测点都是阴性即待测样品不携有该种病毒，判为阴性。6每种病毒的一条以上探针检测点为阳性即待测样品携有相对应病毒，判为阳性。7.3微流控芯片7.3.1微流控芯片的制作微流控芯片的制作方法见附录D。7.3.2检测加样体系样本芯片加样试剂准备：从一20℃取出试剂盒，将各试剂于室温下解冻，充分混匀并短暂离心后使用。取N个(N=待检测样本数)1.5mL离心管，每管加入反应液10μL。加样：在准备好试剂的各个离心管中分别加入15μL不同的待测核酸样本，旋涡振荡混匀，瞬时离心，把各管中混好的样本(25μL)分别加入到微流控芯片中的加样孔中，最后用样本封口膜封住加样孔(见附录D)及透气孔，使用刮片赶走气泡，确保封口膜完全贴合。上机：将上述封装好的芯片的凹处对准微流控芯片检测仪卡扣的凸处，水平彻底按下去即可。程序设置：1600r/min低速离心10s,4600r/min高速离心30s。温度为63.5℃,反应时间为运行：仪器运行后，待温度上升到设定温度，微流控芯片仪开始离心，离心结束后，仪器便开始连续采集荧光信号。阴性对照：不含外源目标核酸序列的DNA片段，单独作为一个样本，加入到加样孔中。阳性对照：从可溯源的标准物质提取核酸，或从含有已知序列阳性样本中提取的核酸，或人工合成的含有目标核酸序列的DNA片段。内参引物：存在于微流控芯片反应孔中，含扩增内参基因片段的引物(非CPV、CPV和CAV-1的引物),用来质控是否可以正常进行恒温扩增反应。内参质粒：人工合成的内参基因序列(非CPV、CPV和CAV-1的基因片段)。7.3.7微流控芯片结果判断7.3.7.1微流控芯片检测仪阈值线设置阈值线一般情况设置为800(可根据实际情况进行调整，设定原则以阈值线刚好超过非典型S型扩增曲线的最高点，且Ct值显示为0),判定为阳性的Ct值设置为30,仪器配套软件自动分析结果。阳性对照出现明显的S型扩增曲线，阴性对照无明显的S型扩增曲线，内参引物检测孔在Ct值≤730时，出现扩增曲线，实验结果有效；否则实验无效。阳性：检测孔在Ct值≤30时，有明显扩增曲线，判定对应检测指标为阳性。注：如果样品做重复实验，扩增多次，只要有一次实验结果判定是阳性，那么该样本判定为阳性样本。8生物安全措施8.1实验室设备、设施要求及废弃物处理应符合GB19489的规定。8.2微流控芯片的检测工作应由具备生物实验操作经验人员承担。8.3检验过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T27401的规定执行。8(规范性)缓冲液配方以下所用试剂均为分析纯。A.1磷酸盐缓冲液A.1.1A液0.2mol/LNaH₂PO₄水溶液：NaH₂PO₄·H₂O27.6g,溶于蒸馏水中，最后稀释至1000mL。0.2mol/LNa₂HPO₄水溶液：Na₂HPO₄·7H₂O53.6g,(或Na₂HPO₄·12H₂O71.6g或Na₂HPO₄·2H₂O35.6g)加蒸馏水溶解，最后稀释至1000mL。A液14mL、B液36mL、NaCl8.5g,加蒸馏水至1000mL。A.220×SCCNaCl175.3g、Na₃C₆H₅O₇·2H₂O88.2g,加超纯水至1000mL。充分溶解，室温保存。A.32×SCC20×SCC50mL,加超纯水至1000mL。充分溶解，室温保存。A.40.2×SCC2×SCC50mL,加超纯水至1000mL。充分溶解，室温保存。A.5DTTMgCl₂(0.1mol/L)DTT15.4g、MgCl₂9.5g,加超纯水至1000mL。充分溶解，室温保存。A.610%SDSSDS100g、超纯水900mL,加热至68℃以溶解SDS结晶，再加超纯水定容至1000mL,室温保存。A.750×Denhardt's聚蔗糖5g、聚乙烯吡咯烷酮5g、BSA5g,加超纯水至500mL。充分溶解，-20℃保存。A.8裂解液尿素30.03g、吐温-201mL,加超纯水至100mL。充分溶解，室温保存。盐酸胍40.12g、异丙醇40mL,加超纯水至100mL。充分溶解，室温保存。9A.10洗液二NaCl0.58g、异丙醇25mL、A.11洗液三无水乙醇80mL,加超纯水至100mL。充分混匀，室温保存。A.12洗脱液1mol/LTris-HCl(pH8.0)1mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL,加超纯水至100mL。充分混匀，1.034×10⁵Pa高压蒸汽灭菌10min,室温保存。超纯水100mL加DEPC50μL,室温过夜，121℃,15min灭菌，或直接购买无RNase超纯水。(规范性)基因芯片引物、探针序列、探针排布及RT-PCR反应体系组成B.1基因芯片引物、探针、质控序列及排布微阵列芯片检测引物序列见表B.1所示，每对引物的上游引物的5'端标记荧光，用于杂交检测。表B.1引物序列引物名称序列(5'-3')引物名称序列(5'-3')CDV1-FGGCAGATGAGTTCTTCAAAACDV1-RCAATTCTAGGCTTGTTCCCCDV2-FGGTGTCAAGGAACAACTGGCDV2-RCTATCCCTCCTAGAGCAAACCAV-1-1-FCGTCCTCACCTAAGCCTAACAV-1-1-RAAGGTAGTAATGTTCAGCGGCAV-1-2-FATGCCGCTGAACATTACTACCAV-1-2-RGAAAGGTTAGCAGGCTTACACPV1-FACTCCAGCAGCTATGAGATCCPV1-RAGCAAATTCATCACCTGTTCCPV2-FCAGGTGATGAATTTGCTACACPV2-RCCATTTGAGTTACACCACG微阵列芯片检测探针序列、质控对照探针序列和探针排布见表B.2所示。探针名称缩写检测病毒序列(5'-3')CTTTCGACCCTTCGTCTACACCTATCCCTCCTAGAGCAAAGTGCCATTGGAGAGACAGAGGAATCATACGGCATCTGGTGAACCCAATGTCTCAGATCTCATGGTAAGCCCAATGCTCTAT表面化学对照-Cy-3质控对照CACATCACTCAGTTATAGTC阴性对照质控对照GACCGCGCTTATACTATAGTC杂交对照质控对照CCCGCTCCGATGGGATAGTC标记对照质控对照CTCAAAAGCCCTTCCTGCCCA阳性对照质控对照GATGGTAGGATAGTGGCCTA微阵列芯片质控对照模板序列见表B.3所示。表B.3质控对照模板序列对照名称对照序列5'-3'杂交对照-GACTATCCCATCGGAGCGGG模板CACGAGGAGTCTGCTACCCGAGAAACCATATTCAGAGCGAATCATCTGTGAGCCGTTTCAGTTGGTTGGTCTCAAAAGCCCTTCCTGCCCAGAGTGATCTCACTCGTCGAGGCCATCGGCTCTGACGCGATATACGGTTGTGCCGAGTGTCAATAGTTTCAAATGAGGTAGCAGACTCCTCGTG将合成的探针用点样缓冲液(50%DMSO)溶解，浓度为50μmol/L,芯片每条探针横向重复3点，每点约0.25nL,点直径约130μm,点间距300μm,点样均匀度的标准方差约为15%。单位为毫米标引序号说明：1——围栏；2——芯片。图B.1检测矩阵在芯片上的排布芯片每个矩阵6行7列，探针排列如图B.2所示。PCPCNCCAV1CAV1AV2AV2NCNC图B.2各检测探针在矩阵中的排布点样后用0.2%SDS洗液清洗2min,用0.2%的封闭液搅拌封闭5min,再用去离子水搅拌清洗3次，最后2000r/min离心1min。将四区域芯片围栏贴于芯片表面，置于暗盒室温保存。B.2反转录反应液体系组成反转录反应液体系包含以下组成：a)总RNA(含3种病毒RNA)1pg～5xg;c)dNTPs(10mmol/L)1μL;f)RnasinlμL;应管中加入d)、e)、f),混匀后，37℃反应2min;再加入g)。PCR反应液体系组成如表B.4所示。组分22211Taq酶(5U/μL)B.4杂交反应液体系基因PCR产物0.5μL、PCR产物5.26μL,将反应液体系混合均匀。B.5说明50×Denhardt’s溶液配方：聚蔗糖5g,聚乙烯吡咯烷酮5g,BSA5g加水至500mL。(规范性)微流控芯片检测试剂盒的试剂组分、存放条件及引物序列微流控芯片试剂组分和存放条件见表C.1所示。表C.1微流控芯片试剂组分和存放条件序号名称存放条件1微流控芯片室温2反应液3核酸裂解液室温CPV检测引物序列见表C.2所示。引物序列F3GTAAACCATGTAGACTAACACAB3GCACTATAACCAACCTCAGCFIPCCTTCAGCTTGAGGCAAAGAATTTA-TACATGGCAAACAAATAGAGCBIPAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGT-GGTCTCATAATAGTAGCTTCAGTCDV检测引物序列见表C.3所示。引物序列F3CGGTGGCTGAATGACATGB3CAAATATTCCTAGCGTCACTACFIPGCTATAGTACATACCTTGGCTTTGG-CATTACTCCAGACAACCAACTBIPGTTGACACTGGCTTCCTTGTG-GAATACCATCTTGTGAACCATTCAV-1检测引物序列见表C.4所示。引物序列AATAGCAGTGGGTTGTCCCTAAGTTGTTAGACAGGTTCCCCAAGCAAAGGTGCACATGA-ATAAATCTATTCAGTTGAGAAGGGTBIPAGTTGGCAATGTTTCCCCCC-AGTGTACGGGATATTCTGTTCPV、CDV和CAV-1三种病毒阳