食品中志贺氏菌检验

关于食品中志贺氏菌检验一、实验目的

了解食品安全与志贺氏菌检验关系1

了解志贺氏菌生理形态化学性质2

掌握志贺氏菌检验方法和结果判断3检验食品中是否有志贺氏菌4第2页,共19页，星期六，2024年，5月二.实验原理需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，能分解葡萄糖，产酸不产气。不发酵乳糖，靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类。第3页,共19页，星期六，2024年，5月三、实验的试剂和仪器仪器与设备试剂和仪器培养基与试剂第4页,共19页，星期六，2024年，5月仪器与设备

规格名称 数量 用途

1、500ml广口瓶 1个 稀释样品

2、500ml三角瓶 1个 制增菌液

3、250ml三角瓶 4个 制培养基

4、18×180mm试管 制三糖铁培养基

5、13×100mm试管 制蛋白胨水等

6、1ml移液管

7、10ml移液管

8、直径为90mm平皿5副 制SS、EMB平板

9、250ml量筒 1个

10、玻璃棒

11.、恒水浴箱1个

12、显微镜1台镜检第5页,共19页，星期六，2024年，5月培养基与试剂GN增菌液 225ml/瓶 1瓶 500ml三角瓶EMB培养基 100ml/瓶 1瓶 250ml三角瓶SS琼脂 100ml/瓶 1瓶 250ml三角瓶三糖铁斜面 6ml/支 6支15×150mm试管葡萄糖半固体培养费基4ml/支 5支13×100mm试管蛋白胨水 2ml/支 5支13×100mm试管 5%乳糖发酵管 3ml/支 5支13×100mm试管甘露醇发酵管3ml/支 5支 13×100mm试管棉子糖发酵管 3ml/支 5支13×100mm试管 甘油发酵管 3ml/支 5支 13×100mm试管 第6页,共19页，星期六，2024年，5月四、实验步骤验步骤实流程图操作步骤第7页,共19页，星期六，2024年，5月流程图

采样

↓样品处理↓选择性增菌↓选择性平板划分↓生化实验↓镜检↓结果报告

第8页,共19页，星期六，2024年，5月实验前的准备对烧杯、玻璃棒、移液管、试管、培养皿、锥形瓶的清洗注意：洗涤后的仪器应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠对试管、玻璃棒、移液管、锥形瓶、烧杯、培养皿进行包扎：要将报纸裁成5-10公分，成30°卷起，结尾处向上折叠即。包扎灭菌第9页,共19页，星期六，2024年，5月培养基的制备1.CN增菌液成分:胰蛋白胨20g柠檬酸钠5g磷酸二氢钾1.5g葡萄糖1g去氧胆碱酸钠0.5g氯化钠5g甘露醇2g磷酸氢二钾4g蒸馏水1000mlph7.0制法：按上述成分配好，加热溶解，校正PH。分装每瓶225ml，115C高温灭菌15min2、HE琼脂成分：蛋白胨12g水杨素2g蒸馏水1000ml乙液20ml牛肉膏3g胆盐20g0.4%溴麝香草芬兰钠溶液16ml乳糖12g氯化钠5g蔗糖12g琼脂20g甲液20mlHP7.5制法：将蛋白胨、乳糖、水杨素、氯化钠、蔗糖、牛肉膏、胆盐等溶解于400ml蒸馏水中作为基础液；加琼脂与600ml蒸馏水中，加热溶解。加入甲液乙液与基础液中，校正HP,再加指示剂。并与琼脂液合并，冷却，倾注平板，第10页,共19页，星期六，2024年，5月培养基的制备3、SS琼脂液的配制成分：牛肉膏0.6g琼脂2.04g三号胆盐0.42g蒸馏水120ml，月示胨0.6g制法：将牛肉膏、月示胨和胆盐溶解于400ml蒸馏水中，将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸使其溶解，再将两液混合121℃高压灭菌15min,保存备用。4、麦慷慨琼脂液的配制成分：蛋白胨2.04g脙胨0.36g猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g氯化钠0.6g琼脂2.04g蒸馏水120mL乳糖1.2g0.01%结晶紫水溶液1.2mL0.5%中性红水溶液0.6mL制法：ⅰ将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2，将琼脂加入于600ML蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于121℃高压灭菌15min备用。ⅱ临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。第11页,共19页，星期六，2024年，5月培养基的制备5、伊红美蓝琼脂（EMB）成分：蛋白胨10g2%伊红溶液20ml乳糖10g0.65%美兰溶液10ml磷酸二氢钾28g蒸馏水1000ml琼脂17gPH7.1制法：将蛋白胨、磷酸盐、琼脂溶解于蒸馏水中，校正ph，分装于烧杯内，121c高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶解琼脂，冷却，加入伊红和美蓝溶液，摇匀。倾注平板。6、三糖铁琼脂的配制成分：蛋白胨4.8g牛肉膏0.6g乳糖1.2g蔗糖1.2g葡萄糖0.12g氯化钠0.6g硫酸亚铁胺0.024g硫代硫酸钠0.024g琼脂0.72g酚红0.003g蒸馏水120mLpH7.4制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用。第12页,共19页，星期六，2024年，5月培养基的制备7、生理盐水的配制成分Nacl0.9g,蒸馏水100ml制法一般每种检样配制250ml生理盐水。称取2.2gNacl，加入250ml蒸馏水溶液；分装于2支大试管中，每支9ml，再量取225ml装入500ml广口瓶中，并加入适量的玻璃珠；剩余的装人另1支试管中，包扎后于121度高压灭菌15min8、氯化钠结晶紫增菌液的配制成分：蛋白胨2.4g氯化钠4.8g0.01%结晶紫溶液0.6mL蒸馏水120mLpH9.0制法：胨晶晶紫外，其他按上述成分配好，加热溶解。约加30%氢氧化钾溶液4.5mL，校正pH。加热煮沸，过滤。再加入结晶紫溶液，混合后分装试管。121℃高压灭菌15min第13页,共19页，星期六，2024年，5月

操作步骤1.灭菌干热灭菌：剪刀及棉绳等干热灭菌湿热灭菌：均质袋、纱布、各种培养基、生理盐水、增菌液2.采样从食堂中取一个鸡蛋3.样品处理将鸡蛋打碎放入无菌碗里，然后用杀菌的玻璃棒搅拌，在放入到均质袋中用均质器打匀4.增菌称取检样25g，加入装有225mlGN增菌液的500ml的广口瓶内，于（36±1）℃培养6-8h第14页,共19页，星期六，2024年，5月操作步骤5.分离取增菌液一环，划线接种于SS琼脂平板一个，伊红美蓝琼脂平板一个，于（36±1）℃培养18-24小时。志贺菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。6.生化试验挑取平板上的可疑菌落，接种三塘铁琼脂和半固体各一管，一般应多挑取几个以防遗漏，志贺菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸，不产气，斜面产碱，不产生硫化氢，无动力，在半固体管内，沿穿刺线生长。7.镜检从三塘铁琼脂和半固体各一管中挑取生长出来的菌落，进行革兰氏染色，然后放在显微镜下观察。8.结果报告第15页,共19页，星期六，2024年，5月五．注意事项1、志贺菌在常温存活期很短。因此，当样品采集后，应尽快进行检验。如果在24h内检验，样品可保存在冰箱内，入欲保存较长时间，必须放在低温冰箱内。2、迄今没有很好的曾菌培养基。目前仍然认为用GN肉汤曾菌检查食品中和粪便中的志贺菌是有效的。第16页,共19页，星期六，2024年，5月注意事项3、增加鉴别培养基的数目，可以增加志贺菌的阳性检出率。用于分离的鉴别培养基一般不少于两个。中等选择性的，HE或SS琼脂平板一个；弱选择性的。麦康凯或EMB琼脂平板一个。WS琼脂可作为中等选择性培养基使用，FX琼脂可作为弱选择性培养基使用。4、动力的观