细胞周期同步化常用的方法

细胞周期同步化常用的方法在一般培养条件下，群体中的细胞处于不同的细胞周期时相之中。为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，常需采取一些方法使细胞处于细胞周期的同一时相，这就是细胞同步化技术。细胞同步化的方法有选择同步化和诱导同步化，其中，选择同步化常用的方法有有丝分裂选择法和细胞沉降分离法。选用DNA合成抑制剂可逆地抑制S期细胞DNA合成而不影响其他细胞周期运转，最终可将细胞群体阻断在G1/S期交界处；一些抑制微管聚合的药物，因抑制有丝分裂装置的形成和功能行使，可将细胞阻断在有丝分裂中期，即使细胞同步于M期。一、M期同步化方法1．振荡收集法该法利用M期细胞变圆易脱落的特点，将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间隔振荡，使M期细胞脱落，逐步收集培养基，并补充新的培养基。收集的细胞放4℃冰箱中保存，离心沉淀后即获得M期细胞。2．秋水仙素阻抑法（1）将细胞传代培养至指数生长期。（2）加入秋水仙胺，使最终浓度为0.05－0.1μg/mL培养基，作用6－7h。如使用秋水仙素，使用浓度应加大5～10倍。（3）振荡收集细胞，800r/min离心5－10min，弃上清，收集的沉淀细胞即为M期细胞。加入一定量培养基将细胞接种到培养瓶中或直接进行离体实验。由于秋水仙素或秋水仙胺对细胞有一定毒性，用量较小或作用时间较短细胞活性尚可恢复，而用量过大或时间过长则细胞不能存活，因此使用时应严格控制其剂量和作用时间。3．N2阻断法此方法较秋水仙素阻抑法好（1）将细胞传代培养至指数生长期。（2）将培养瓶置于N2罐中通入适量CO2（约相当于罐中体积的5％）。（3）关闭好N2罐，接上N2管子及压力表，缓缓向罐中充气一直到压力为80-90磅/英寸2为止。（4）将N2装置放在37℃培养箱中10－16h（通常过夜）。次日从培养箱中取出，然后缓缓将N2放出（最好放出窗外）。（5）取出细胞在镜下观察同步化效果，用振荡法收集细胞于离心管中。（6）800r/min离心10min收集细胞。二、S期同步化方法胸腺嘧啶核苷（TdR）双阻断法：该法利用过量TdR能阻碍DNA合成的原理而设计，为了加强细胞同步化效果，常采用两次TdR阻断法，即双阻断法。第1次阻断时间相当于G2、M和G1期时间的总和或稍长，释放时间不短于S期时间，而小于G2+M+G1期时间，这样才能使所有位于G1/S期的细胞通过S期，而又不使沿周期前进最快的细胞进入下一个S期。第2次阻断时间同第1次，再释放。现以HeLa细胞为例加以说明（HeLa细胞周期时间为21h，其中G1期为10h，S期为7h，G2期为3h，M期为1h）。1．将细胞培养至指数生长期的早期。2．加入含2mmol/LTdR的培养基（2－2.5mmol/L用于肿瘤细胞的同步化培养），作用16h。3．弃掉TdR培养基，用Hanks液洗2－3次，再换上新鲜培养基继续温浴9h。4．重新加入TdR培养基（浓度同上）进行第2次阻断，作用16h。5．再弃掉TdR培养基，Hanks液洗2－3次后换上普通培养基。第2次TdR释放0h时取样则细胞处于G1/S期交界处；如2－7h取样则为不同阶段的S期细胞。注意：具体TdR作用和释放的时间应参考每一种待同步化细胞的细胞周期各时相测定的参考值，也可根据经验确定。三、G1期和G2期细胞的获得1．G2期细胞的获得根据细胞周期测定的数值，采用TdR双阻断法使细胞同步在G1/S期交界处后，洗去TdR使细胞释放后继续培养。其培养时间应大于S期时间而小于S+G2期时间。然后先用振荡法使已进入M期的细胞脱落，弃去上清培养基；再用胰酶消化，加入新鲜培养基制成细胞悬液，离心收集细胞，即为G2期细胞。2．G1期细胞的获得（1）将用M期阻断法获得的细胞加入一定量的培养基，继续培养1－10h即可获得各阶段的G1期细胞。（2）用缺乏异亮氨酸的培养基培养细胞，培养时间超过一个细胞周期，即可获得中G1期细胞。四、G0期细胞的获得可采用血清饥饿法得到G0期细胞。1．取处于对数生长期的细胞。2．用含0.5％－1％小牛血清的培养基培养细胞48－72h。或用无血清的培养基培养24h。3．用0.1％－0.25％胰蛋