谈HPLC 法测定家兔血浆中士的宁的浓度

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中药马钱子为马钱科植物马钱(Strychnosnux-vomica)或云南马钱(Strychnospierriana)的干燥成熟种子，具有通络止痛、散结消肿等功效[1]。士的宁既是马钱子的主要有效成分又是有毒成分，占马钱子总生物碱的50%左右[2]。2010版《中国药典》所收录的含马钱子的中成药多以片剂、丸剂、胶囊剂等口服用药为主，且马钱子在中成药中均为君药、臣药，表明马钱子治疗作用突出。但目前以马钱子粉或含马钱子中成药入药的药动学研究均为大鼠灌胃，既难以进行临床用药剂型研究，又难以实现同一动物多次取血，较难体现药物在同一个体内的药动学真实情况，而家兔灌胃含马钱子中成药的药动学相关研究尚未见报道。本实验采用单因素考察，确定含药血浆处理方法;建立高效液相色谱(HPLC)法测定家兔血浆中士的宁的浓度。以期对含马钱子中成药口服类用药的药动学研究提供方法借鉴，以指导临床安全用药。

1材料与方法

材料

仪器1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，G1329B自动进样器，G1314FVWD检测器;TDL-40B型离心机(上海安亭科学仪器厂);TG16-WS台式高速离心机(长沙湘仪离心机有限公司);MX-S可调式混匀仪(北京大龙兴创实验仪器有限公司);AL104型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);AE240型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);KQ-700DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);TDA-8002型水浴锅(余姚明伟仪表厂)。

药品与材料士的宁对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，按%计;批号：110705-201307);庚烷磺酸钠(色谱纯，天津市光复精细化工研究所;批号：20140305);腰痛宁胶囊(颈复康药业集团有限公司;批号：491044);甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯;实验用水为超纯水。实验用血浆取自新西兰兔[许可证号：SCXK(京)2014-0003]。

色谱条件

色谱柱为Agilent5TC-C18柱(250mm×mm，5μm)和AgilentTC-C18预柱(mm×mm，5μm);流动相：甲醇-mol/L庚烷磺酸钠与mol/L磷酸二氢钾等量混合(用10%磷酸调pH至)-乙腈(∶∶);检测波长：254nm;流速：mL/min;柱温：25℃。

标准储备液的配制

精密称取士的宁对照品适量置10mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成浓度为mg/mL的士的宁储备液，4℃冷藏备用。

标准溶液的配制

精密吸取士的宁储备液适量，用流动相稀释，得到质量浓度为、、、、、、μg/mL的士的宁系列标准溶液，4℃冷藏备用。分别将、、μg/mL士的宁标准溶液用流动相稀释5倍，所得溶液，分别标记为士的宁标准溶液a、b、c，4℃冷藏备用。

血浆样品处理

碱液种类及浓度考察精密吸取家兔空白血浆mL置50mL尖底离心管中，加入μg/mL士的宁流动相溶液20μL，涡旋30s，配制成一定浓度的含药血浆;加异丙醇-甲醇(4∶1)混合溶剂mL，分别考察加入mL氨水，mL的1、2、3mol/LNaOH溶液，涡旋30s，冷水中超声15min，加入正己烷-二氯甲烷-异丙醇(60∶35∶5)4mL，涡旋1min，3000r/min离心10min，收集下层液，于37℃水浴氮气吹干，用100μL流动相复溶，涡旋1min，12000r/min离心15min，得供试品溶液，进样70μL测定[8-10]。另取士的宁标准溶液b，直接进样70μL测定峰面积。将供试品溶液所得士的宁峰面积与对照品流动相溶液的峰面积比较，计算士的宁绝对回收率，结果分别为%、%、%、%。由结果可得2mol/LNaOH溶液与3mol/LNaOH溶液、氨水的绝对回收率差别不大，但氨水挥发性强，综合考虑选择2mol/LNaOH溶液。

萃取次数的考察考察碱液为2mol/LNaOH溶液时，萃取次数分别为1次和2次时士的宁的绝对回收率。萃取1次方法同“”项下方法;萃取2次方法同“”项下方法，重复萃取过程2次，合并2次下层液，于37℃水浴氮气吹干，用100μL流动相复溶，涡旋1min，12000r/min离心15min，得供试品溶液，进样70μL测定。士的宁绝对回收率结果分别为%和%，表明萃取2次结果更佳。

萃取剂种类的考察考察碱液为2mol/LNaOH溶液，萃取次数为2次，分别以氯仿、二氯甲烷、氯仿-甲醇(9∶1)、二氯甲烷-甲醇(9∶1)、正己烷-二氯甲烷-异丙醇(60∶35∶5)作萃取剂时士的宁的绝对回收率。同“”项下方法萃取2次，结果分别为%、%、%、%、%。根据结果可得二氯甲烷和二氯甲烷-甲醇(9∶1)所提士的宁的绝对回收率较为理想，但二氯甲烷萃取后样品杂质较少，同时考虑操作从易的原则，选择二氯甲烷作为萃取剂。

萃取剂加入量的考察考察碱液为2mol/LNaOH溶液，萃取次数为2次，萃取剂二氯甲烷每次加入量为3、4、5、6mL时士的宁的绝对回收率。同“”项下方法萃取2次，结果分别为%、%、%、%。由结果可得加入量为5mL时，士的宁的绝对回收率较理想，故选择每次加入量为5mL。继续考察萃取剂为二氯甲烷，第1次加入量为5mL，第2次加入量分别为3、4、5mL时士的宁的绝对回收率。方法同上，结果分别为%、%、%。由结果可知，第2次加入量为4mL和5mL时结果均较理想，从节约资源的角度考虑，选择第2次加入4mL。

加萃取剂后涡旋时间考察考察碱液为2mol/LNaOH溶液，萃取次数为2次，萃取剂为二氯甲烷，第1次5mL，第2次4mL，涡旋时间分别1、3、5min时士的宁的绝对回收率。同“”项下方法萃取2次，结果分别为%、%、%。根据结果，涡旋3min和5min易产生乳化，使回收率降低，故选择涡旋1min。

破膜剂种类考察考察碱液为2mol/LNaOH溶液，萃取次数为2次，二氯甲烷萃取涡旋1min，第1次5mL，第2次4mL，破膜剂分别为异丙醇-甲醇(4∶1)、异丙醇-甲醇(1∶1)和乙腈时士的宁的绝对回收率。同“”项下方法萃取2次，结果分别为%、%、%。结果表明，乙腈做破膜剂较为理想。

血浆样品处理方法综合以上筛选，确定血浆样品处理方法为：精密吸取含药血浆mL置50mL尖底离心管中，加乙腈和2mol/LNaOH溶液各mL，涡旋30s，置冷水中超声15min，再加二氯甲烷5mL，涡旋1min，3000r/min离心10min，收集下层液;剩余血浆再加二氯甲烷4mL，涡旋1min，3000r/min离心10min，收集下层液;合并2次下层液，于37℃水浴氮气吹干，用100μL流动相复溶，涡旋1min，12000r/min离心15min，得供试品溶液，进样70μL测定。

2结果

方法专属性

将“家兔空白血浆+士的宁对照”样品、家兔灌胃腰痛宁胶囊后的含药血样、家兔空白血浆，按“”项下方法操作，考察方法专属性。

线性关系试验

精密吸取7份家兔空白血浆各mL，分别加入士的宁对照品系列标准溶液20μL，涡旋30s，配制成相当于士的宁浓度为、、、、、、ng/mL的系列标准样品，再按“”项下方法操作。以士的宁血浆浓度C(ng/mL)为横坐标X，峰面积A为纵坐标Y，建立标准曲线;用加权(1/C2)最小二乘法进行线性回归运算;以S/N=10测定最低定量限。得线性回归方程为：Y=X+，r=，线性范围为：~ng/mL，最低定量限为ng。

回收率试验

同“”项下方法配制低、中、高3个浓度(、、ng/mL)质控血浆样品各5份，按“”项下方法操作，同时绘制随行标准曲线，记录士的宁峰面积AT，计算质控血浆样品中士的宁浓度，用实测浓度平均值与理论浓度比较，求得方法回收率;另取士的宁标准溶液a、b、c各5份，直接进样70μL，记录士的宁峰面积AS，用AT平均值与AS平均值比较，求得绝对回收率，结果表明士的宁的绝对回收率均>70%，方法回收率：低浓度在80%~120%，中、高浓度在85%~115%，均符合要求。

精密度试验

精密吸取家兔空白血浆mL，加入流动相配制的士的宁系列浓度对照品溶液20μL，涡旋30s，配制成低、中、高3个浓度(、、ng/mL)的质控血浆样品，每个浓度5份样品，按“”项下方法操作，于1d内每个浓度每份样品测定1次，同时绘制随行标准曲线，记录士的宁峰面积，计算质控样品中士的宁浓度，求得3个浓度的日内精密度;连续测定5d，每天每个浓度1个样品，每个样品测定1次，每天绘制1条随行标准曲线，记录士的宁峰面积，计算质控样品中士的宁浓度，求得3个浓度的日间精密度，结果表明低浓度日内、日间精密度均<20%，中、高浓度均<15%，结果均良好。

稳定性试验

考察3个浓度(、、ng/mL)质控样品在室温放置0、4、8、12、24h的稳定性;-20℃及室温冻融循环0~3次的稳定性;-20℃保存0、5、10、15、20d的稳定性。结果3个浓度样品峰面积的平均值与0h或0次测定值的偏差绝对值均在5%以内，表明质控样品室温放置24h内和冻融循环3次以内稳定性良好;15d和20d样品中士的宁发生了分解，0、5、10d所得数据计算偏差绝对值，结果均在5%以内，证明样品在10d内稳定性良好。3个浓度(、、ng/mL)质控样品，按“”项下方法操作得到供试品溶液，考察室温放置0、4、8、12、24h的稳定性。结果3个浓度质控样品峰面积测定值的平均值与0h测定值的偏差绝对值均在5%以内，表明血样处理后室温放置24h内稳定性良好。

3讨论

目前对含马钱子的中成药或马钱子粉的药动学研究均为大鼠灌胃，难以对同一动物多个时间点取血，因存在个体差异性，无法体现药物在同一个体内药动学的真实情况;而家兔灌胃可以实现多点采血，解决了这一问题。故本实验建立了测定家兔血浆中士的宁的检测方法。本实验曾试过PhenomenexC18柱、KromasilC18柱、InertsilODS-3柱等，但有拖尾、峰展宽或分离困难等现象，最终确定为AgilentTC-C18柱，峰分离良好，无拖尾和峰展宽情况，理论塔板数符合要求。在实验初期，发现士的宁甲醇溶液进液相检测不成线性，而改为士的宁流动相溶液则成线性，可能是由本实验流动相的水相比例偏大造成的，故最终选择用流动相稀释和样品定容。

样品处理过程中发现，加入萃取剂后超声与否对绝对回收率无影响，说明加碱液已经使士的宁游离，可直接萃取;氮气吹干时水浴温度为50℃时绝对回收率降低，可能高温使一些内源性物质对士的宁产生降解或与之结合，故最终选择37℃。另外，含药血浆在-20℃储存15d和20d，发