分子生物学基础了解省公共课一等奖全国赛课获奖课件

第五章分子生物学研究方法第1页分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要原因就是当代分子生物学研究方法、尤其是基因操作和基因工程技术进步。DNA分子切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析基因人工合成基因操作基因定点突变PCR扩增等关键技术第2页基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，组成遗传物质新组合，使之进入原先没有这类分子寄主细胞内并进行连续稳定繁殖和表示。外源核酸分子在另一个不一样寄主细胞中繁衍与性状表示过程.基因工程技术区分于其它技术根本特征：含有跨越天然物种屏障、把来自任何生物基因置于毫无亲缘关系新寄主生物细胞之中能力。本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆惯用载体系统以及基因分离与判定等三个步骤。

第3页第4页三大成就

：1.40年代确定了遗传信息携带者，即基因分子载体是DNA而不是蛋白质，处理了遗传物质基础问题；BacterialStrainInjectionResultsLivingScellsLivingRcellsHeatkilledScellsHeatkilledScellsmixedwithlivingRcellsLivingScellsinbloodsamplefromdeadmousecapsule1928FrederickGriffith&1944Oswald

AveryTransformationofStreptococcuspneumoniae第5页1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌试验第6页2.50年代揭示了DNA分子双螺旋结构模型和半保留复制机制,处理了基因自我复制和世代交替问题；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&Wilkins第7页Descriptionofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatson第8页ConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselson&FranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway第9页3.50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息流动和表示。JacobandMonod第10页不过，假如没有分离和富集单一DNA分子技术，科学家就无法对这类物质进行直接生化分析。第11页两大技术确保：1.DNA体外切割和连接1962年Arber发觉限制性核酸内切酶，1967Gellert发觉了DNA连接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’第12页HerbertBoyer,StanleyCohen1972年取得第一个重组DNA分子HerbertBoyer第13页第14页重组DNA试验中常见主要工具酶酶

类功

能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶经过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5'到3'方向加入新核苷酸，补平DNA双链中缺口反转录酶按照RNA分子中碱基序列，依据碱基互补标准合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链5'-OH末端（进行末端标识试验或用来进行DNA连接末端转移酶在双链核酸3'末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶III从DNA链3'末端逐一切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链5'末端逐一切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5'或3'末端磷酸基团

到当前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。第15页1972-PaulBerg,ProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA第16页仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA切割和重组远不能满足基因研究需要。DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。这就是基因克隆，或分子克隆。第17页分子克隆载体----具备自主复制能力DNA分子（vector），如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都能够作为基因导入载体。第18页从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最惯用转化受体。1970年Mandel和Higa发觉，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理大肠杆菌细胞一样能够摄取质粒DNA。第19页1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies第20页表明：

（1）像pSC101这么质粒DNA分子能够作为基因克隆载体，从而把外源DNA导入寄主细胞；（2）像非洲爪蟾这么高等生物基因也能够被成功地转移到原核细胞中并实现其功效表示；（3）质粒DNA-大肠杆菌细胞作为一个成功基因克隆体系，有可能在重组DNA或基因工程研究中发挥主要作用。第21页2.DNA核苷酸序列分析技术DNA核苷酸序列分析法是在核酸酶学和生物化学基础上创建并发站起来一门主要DNA技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因结构与功效关系，以及克隆DNA片断操作方面，都有着十分广泛使用价值。第22页Generalprocessofgeneengineering1.从生物有机体基因组中，分离出带有目标基因DNA片段。2.将带有目标基因外源DNA片段连接到能够自我复制并含有选择记号载体分子上，形成重组DNA分子。3.将重组DNA分子转移到适当受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4.从大量细胞繁殖群体中，筛选出取得了重组DNA分子受体细胞，并筛选出已经得到扩增目标基因。第23页5.将目标基因克隆到表示载体上，导入寄主细胞，使之在新遗传背景下实现功效表示，研究核酸序列与蛋白质功效之间关系。第24页5.2

DNA操作技术

5.2.1核酸凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA凝胶电泳技术，已经发展成为一个分析判定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用主要试验伎俩，也是现在通用许多分子生物学研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等技术基础，受到科学界高度重视。

第25页5.2.1.1基本原理

一个分子被放置到电场中，它就会以一定速度移向适当电极。我们把这种电泳分子在电场作用下迁移速度，叫做电泳迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳分子所携带净电荷数量越多，其迁移速度越快，反之则较慢。因为在电泳中往往使用无反应活性稳定支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，故电泳迁移率与分子摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度函数，所以，依据分子大小不一样、构型或形状差异以及所带净电荷多寡，便能够经过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中各种成份彼此分离开来。第26页在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中磷酸基团，是呈离子化状态，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极方向迁移。因为糖-磷酸骨架在结构上重复性质，相同数量双链DNA几乎含有等量净电荷，所以它们能以一样速度向正电极方向迁移。在一定电场强度下，DNA分子这种迁移速度，亦即电泳迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。大分子量DNA移动慢小分子量DNA移动快电泳缓冲液阳极阴极DNA加样孔第27页第28页第29页琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨DNA片段范围为0.2~50kb之间第30页聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间第31页凝胶类型及浓度分离DNA片段大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝胶分辨能力同凝胶类型和浓度相关，凝胶浓度高低影响凝胶介质孔隙大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。第32页在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（ethidiumbromide，简称EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg微量DNA，也能够被清楚地检测出来。在紫外线照射下结合溴化乙锭DNA分子发出荧光第33页称样溶解加热制板倒胶电泳操作基本程序第34页取样点样电泳检测第35页结果第36页5.2.2核酸分子杂交将带有互补特定核苷酸序列单链DNA或RNA混合在一起，其对应同源区段就会退火形成双链结构。假如退火核酸来自不一样生物有机体，所形成双链分子就被称为杂种核酸分子。第37页不一样温度下DNA构型改变一DNA/DNA杂交作用，能够用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而形成DNA/RNA间杂种分子能力可被用来揭示核酸片段中某一特定基因位置。第38页不一样温度下DNA构型改变二第39页在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离DNA或RNA分子，都必须经过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中位置原封不动地“吸印”上去，所以，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。SouthernBlottingE.M.Southern于1975年首先设计出来。材料：尼龙滤膜硝酸纤维素滤膜二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）步骤：第一，将分离核酸样品转移到固体支持物滤膜上－核酸印迹转移电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法第二，是将含有核酸印迹滤膜与带有放射性或其它标识DNA或RNA探针进行杂交第40页杂交模式图放射自显影DNA印迹转移探针杂交－＋第41页SouthernBlotting过程1.碱变性琼脂糖凝胶电泳分离DNA2.经过电泳液移动转移胶中DNA3.固定胶中DNA4.预杂交和杂交（放射性和荧光检测）5.结果检测第42页在理想条件下，应用放射性同位素标识特异性探针和放射自显影技术，即便每带电泳条带仅含有2ngDNA也能被清楚地检测出来。因为放射性同位素对人体危害，近年来又发展了荧光法检测杂交信号技术，即使灵敏度略低于同位素法，却使核酸杂交试验变得更为安全。惯用荧光染料：C5、C3等第43页2.Northernblotting（诺赛恩RNA印迹技术）是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰活性滤纸上，进行核酸杂交一个试验方法。NorthernHybridization

IsolatemRNA(DifferentLengths)ProbewithlabeledDNA第44页3.Westernblotting（韦斯顿蛋白质杂交技术）将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标识特定蛋白质之抗体进行反应。Step1.AntibodyRecognitionoftargetprotein/antigenStep2.SecondaryAntibodyrecognitionofprimaryAbStep3.ColorDevelopment第45页检测重组体克隆菌落杂交技术原位杂交第46页InsituhybridizationLocalizationofDNALocalizationofRNA第47页1.将快速生长中大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。

所谓细菌转化，是指一个细菌菌株因为捕捉了来自另一个细菌菌株DNA而造成性状特征发生遗传改变生命过程。提供转化DNA菌株叫作供体菌株，接收转化DNA细菌菌株则被称为受体菌株。处于能够接收外源DNA状态细胞称为感受态细胞。5.2.3细菌转化步骤：第48页2.与转化混合物中外源DNA形成粘附在细胞表面复合物。3.马上将该体系转移到42℃下做短暂热刺激，复合物便会被细胞所吸收。4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表示、细胞活性恢复5.涂布于选择性培养基中分离转化子。第49页5.2.4基因扩增聚合酶链式反应，即PCR技术，是一个在体外快速扩增特定基因或DNA序列方法，故又称为基因体外扩增法。DNA聚合酶含有在核苷酸底物存在下，以一条DNA链为模板催化新链合成需要含有3’-OH引物含有5’到3’方向聚合能力通常含有3’到5’外切酶活性第50页PCR技术原理并不复杂：第51页一．DNA体外扩增技术

1.

PCR反应体系

1)基本原理

PCR技术基本原理类似于DNA天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤组成：第52页PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成双链DNA解离，使之成为单链，方便它与引物结合，为下轮反应作准备；第53页PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA与引物退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链互补序列配对结合；第54页PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新与模板DNA链。第55页Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目基因扩增放大几百万倍。第56页TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon第57页2.降低反应温度（约50℃），致冷1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端互补序列位置上;3.将反应混合物温度上升到72左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶作用下，从引物3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互补链1.首先是将含有待扩增DNA样品反应混合物放置在高温（>91℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA；4.重复以上操作PCR过程DNA解链（变性）引物与模板DNA相结合（退火）DNA合成（链延伸）第58页一次循环2二次循环4三次循环8两条引物结合位点之间DNA区段拷贝数，理论上最高值应是2n第59页PCR仪第60页5.2.5核苷酸序列分析1968年华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略Sanger在它基础之上发展了快数测定DNA末端终止法KMullis完善了PCR扩增DNA方法第61页5.2.5.1.

Sanger双脱氧链终止法(dideoxy-terminationsequencing)

原理：双脱氧（2'，3'）-核苷酸能够象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成DNA链中，但因3’端不具OH基，DNA链合成至此中止。因为双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入位置不一样，故可依据不一样长度DNA片段测定出核苷酸序列。不能和下一个核苷酸经过磷酸二酯键连接起来第62页AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’添加DNApolymerase全部4dNTPs其中一个标识ddNTPddTTPddCTPddGTPddATP在四个不一样反应管中各只包含一个ddNTP.第63页AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGATreactionCreactionGreactionAreaction每一管中复制序列都停留在ddNTPs处5’第64页反应终止后，四个反应管中反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离.这四个反应管中延伸寡核苷酸仅相差一个碱基.电泳结构经过显色指示.

TCG

A3’CCTTTAGCT5’第65页

过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标识）和一个双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影。`

该法亦适合mRNA序列分析。

GC富集区常出现“隐影”或“停顿”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可处理GC富集区测序。第66页第67页2.DNA定序普通程序

酶法测序(Sanger)

化学测序法(Maxam-Gilbert)

待测DNA片段待测DNA片段

↓

↓次克隆5’-末端标识

↓筛选重组子链分离限制酶切

↓模板增殖与纯化↓

↓纯化标识ss-DNA

与引物退火↓

↓定序反应定序反应

↓聚丙烯酰胺凝胶电泳

↓真空干燥

↓放射自显影

↓阅读序列和计算机录入

↓核苷酸序列分析与比较第68页二.DNA序列测定自动化

1.DNA测序步骤与自动化1）模板制备可自动化2）定序反应可自动化3）凝胶电泳自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。4）核苷酸序列阅读与计算机输入可自动化2.自动测序仪

Conney等人于1987年设计了不一样荧光染料标识引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。

红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）

黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP）

绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP）

兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）第69页第70页优点：i.四个反应系统可合并点样，大大节约制胶和点样时间；

ii.可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；

iii.可连续电泳，可读出较多核苷酸序列。缺点：无法保留原始统计,四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰,造成读序时分辨率下降。DNA序列分析自动化包括两个方面内容，一是指“分析反应”自动化，其次则是指“读片过程”自动化。第71页第72页5.2.5.3.杂交测序自从70年代末期DNA测序技术问世以来，人们已经做了大量主要改进，但从根本原理上创新则只有杂交测序法（sequencingbyhybridization，SBH）一个。它利用一组已知序列寡核苷酸短序列作探针，同某一特定较长靶DNA分子进行杂交，从而测定其核苷酸序列。DNA杂交测序实质上包含两个主要步骤首先是将待测定靶DNA分子同一组已知其核苷酸次序寡核苷酸探针进行杂交，然后与那些能够同靶DNA形成完全双链杂合分子寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶DNA核苷酸序列。第73页假如将一个核苷酸次序为5'-AGCCTAGCTGAA-3'12-mer靶DNA，与一组完全随机8-mer寡核苷酸探针混合杂交，在总数为48=65536种8-mer探针群体中，仅有5种会与靶DNA形成完全互补双链体分子。依据这5种发生了完全杂交作用8-mer寡核苷酸探针之间重合序列线性关系，便可推算出这段12-mer靶DNA分子核苷酸次序。当然，这只是一个理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂得多，因为那些没有同靶DNA片段完全互补寡核苷酸探针，也依然会与之形成不稳定双链分子。第74页上图是两条长度均为17-mer靶DNA片段I和II杂交测序结果，二者仅在第8位碱基有不一样，分别为C和T。靶DNA片段I可与1~8共8段彼此相互重合8-mer寡核苷酸形成完全双链分子，但不能与第9段8-mer寡核苷酸形成完全双链分子。依据相邻两段8-mer寡核苷酸之间各自含有7个碱基重合情况，能够构建出互补DNA序列。靶DNA片段II杂交结果表明，横跨其第8位碱基T6段8-mer寡核苷酸双链体，因为含有内部碱基错配，所以其杂交效率显著下降；但与第1和第8两段8-mer寡聚体形成含有末端G-T错配双链分子，其稳定性下降并不显著。与第9段8-mer寡核苷酸能杂交形成完全双链体分子，证实与片段I相比，它在第8位发生了由C碱基到T碱基改变。第75页（基因芯片测序)第76页基因芯片测序流程第77页

5.2.6.1.

凝胶阻滞试验

凝胶阻滞试验（gelretardationassay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNAmobilityshiftassay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用一个特殊凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，因为电场作用，裸露DNA朝正电极移动距离与其分子量对数成反比。假如此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，因为分子量增大，它在凝胶中迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动距离也就对应缩短了。所以，当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中某种特殊蛋白质分子相结合了。5.2.6DNA与蛋白质相互作用研究第78页凝胶阻滞试验基本原理图放射性标识DNA因为与一个细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中展现滞后条带ACB放射自显影****凝胶电泳放射性标识DNA细胞蛋白质提取物蛋白质与DNA结合******BDNA-蛋白质结合物电泳迁移迟缓滞后带表明DNA与蛋白质结合第79页5.2.6.2.

DNaseI足迹试验

在DNaseI足迹试验（DNAfoot-printingassay）过程中，首先将待检测双链DNA分子用32P作末端标识，并用限制性内切酶去掉其中一个末端，得到只有一条链单个末端标识双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少许DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化DNA分子，并控制酶用量使之到达平均每条DNA链只发生一次磷酸二酯键断裂。假如蛋白质提取物中不存在与DNA结合特异蛋白质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标识末端1个、2个、3个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸连续DNA片段梯度群体。假如有一个蛋白质已经结合到DNA分子某一特定区段上，那么，它就将保护这一区段DNA免受DNaseI消化作用，因而也就不可能产生出对应长度切割条带。在电泳凝胶放射自显影图片上，对应于蛋白质结合部位是没有放射标识条带，出现了一个空白区域，人们形象地称之为“足迹”。第80页32p1510*14810*加入蛋白质X加入DNaseI凝胶电泳放射自显影1510AB足迹(a)(c)(b)DNaseI足迹试验第81页5.3基因克隆主要载体系统

1.最少有一个复制起点，因而最少可在一个生物体中自主复制。

2.

最少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。

3.

最少应有一个遗传标识基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞

4.安全性大肠杆菌载体pBR322结构图

载体特点基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞自主复制DNA分子。第82页5.3.1质粒DNA及其分离纯化细菌质粒是存在于细胞质中一类独立于染色体并能自主复制遗传成份。绝大多数质粒都是由环形双链DNA组成复制子，也有线性质粒报道。质粒DNA分子能够连续稳定地处于染色体外游离状态，也可能在一定条件下被可逆性整合到寄主染色体上，伴随染色体复制而复制，并经过细胞分裂传递到后代。应用质粒作为基因克隆载体分子，最主要前提是要取得大量纯化质粒DNA分子。第83页

E．coli质粒种类

1)colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。

2)R因子（抗药性因子）

可接合转移DNA，属低拷贝严紧型，质粒较大，操作不便

3)F因子（性因子）第84页关键步骤：寄主细胞裂解作用是分离质粒DNA试验操作。通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促使大肠杆菌细胞裂解。假如寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低质粒DNA回收率。假如细胞裂解反应相当温和，同时试验操作又十分慎重仔细，那么绝大部分染色体DNA分子都将以高分子量形式释放出来，能够用高速离心方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去，得到高纯度质粒DNA。第85页质粒载体DNA分离关键：怎样使质粒DNA与宿主染色体DNA分开原理：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA抽提过程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持超螺旋构型变性法：变性条件可采取加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于ss环状病毒DNARF型分离,质粒DNA氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）第86页5.3.1.1.氯化铯密度梯度离心法试验表明，在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量细菌染色体DNA轻易发生断裂形成对应线性片段，而质粒DNA则因为其分子量较小、结构紧密，所以仍能保持完整状态。这种差异对质粒DNA纯化是十分有用。上清液加入固体CsCl与EtBr溶液室温下超速离心(45,000rpm）16小时穿孔取出DNA（320nm）异丙醇抽提溴乙锭缓冲液透析除去残余CsCl两倍体积冷乙醇沉淀DNA离心、洗涤、干燥第87页5.3.1.2.碱变性法

经过氯化铯-EtBr密度梯度离心法即使能够得到高纯度、高质量质粒DNA，但它操作复杂，需要价格昂贵氯化铯和超速离心机设备，而且溴化乙锭又是一个致癌物质，假如操作不慎，不但会造成环境污染，还会危及试验工作人员身心健康。试验观察发觉，在pH值介于12.0~12.5条件下加热DNA溶液，使染色体DNA变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生快速改变时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。随机断裂产生线性染色体DNA分子，彼此已经分离互补链之间复性作用就不会那么快速而准确，往往聚集形成网状结构，与变性蛋白质及RNA一道被离心沉淀下来。用酒精沉淀法能够搜集依然滞留在上清液中质粒DNA。第88页5.3.2主要大肠杆菌质粒载体5.3.2.1.

pSC101质粒载体pSC101是一个严紧型复制控制低拷贝数大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1～2个拷贝。其分子大小为9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr）。。

pSC101质粒不但含有可插入外源DNA多个限制性核酸内切酶单克隆位点，而且还含有四环素抗性强选择记号，所以，它被选为第一个真核基因克隆载体。当然，这个质粒载体也有其显著缺点，它是一个严紧型复制控制低拷贝质粒，从带有该质粒寄主细胞中提取pSC101DNA，其产量就要比其它质粒载体低得多。第89页5.3.2.2.

ColE1质粒载体

ColE1质粒属于松弛型复制控制多拷贝质粒。在正常生长条件下，当培养基中用于蛋白质合成氨基酸被耗尽，或是在对数生长末期细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质合成，寄主染色体DNA复制便被抑制，细胞生长也随之停顿。此时，松弛型复制控制质粒DNA依然能够继续进行复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积ColE1质粒拷贝数增加到1000~3000个之多，质粒DNA大约可占细胞总DNA50%左右。由此可见，因为质粒拷贝数高，插入外源DNA片段产量也就得到对应提升。

第90页5.3.2.3.

pBR322质粒载体为改进转化子筛选技术，有必要用人工方法构建一个既带有各种抗药性强选择记号、又含有低分子量、高拷贝、以及外源DNA插入不影响复制功效各种限制性核酸内切酶单切割位点等优点新质粒载体。

pBR322质粒是由三个不一样起源部分组成：第一部分起源于pSF2124质粒转座子Tn3氨苄青霉素抗性基因（ampr）；第二部分起源于pSC101质粒四环素抗性基因（tertr）；第三部分则起源于ColE1派生质粒pMB1DNA复制起点（ori）。123第91页第一个优点：含有较小分子量，其长度为4,363bp。因为分子量小，不但易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb外源DNA片段，操作起来仍较为便利。第二个优点：含有两种抗生素抗性基因以用作转化子选择记号。质粒DNA编码抗生素抗性基因插入失活效应，是检测重组体质粒一个十分有用方法。第三个优点：具较高拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体DNA制备提供了极大方便。pBR322质粒载体优点第92页5.3.2.4.

pUC质粒载体pUC系列质粒载体包含以下四个部分：(i)来自pBR322质粒复制起点（ori）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它核苷酸序列已经发生了改变，不再含有原来限制性核酸内切酶单识别位点；(iii)大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）开启子及其编码α-肽链DNA序列，此结构特称为lacZ‘基因；(iv)位于lacZ'基因中靠近5'-端一段多克隆位点（MCS）区段，它并不破坏该基因功效。第93页

第一，更小分子量和更高拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子缩小了许多，如pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。同时，因为rop基因缺失，使pUC8质粒拷贝数比带有pMB1或ColE1复制起点质粒载体都要高得多，不经氯霉素扩增，平均每个细胞即可达500~700个拷贝。

第二，可用组织化学方法检测重组体。pUC8质粒结构中含有来自大肠杆菌lac操纵子lacZ'基因，所编码α-肽链可参加α-互补作用。所以，可用X-gal显色法实现对重组体转化子判定。

第三，含有多克隆位点MCS区段，能够把具两种不一样粘性末端（如EcoRI和BamHI）外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。pUC质粒载体优点：第94页5.3.2.5.

pGEM-3Z质粒

pGEM-3Z是一个与pUC系列十分类似小分子质粒载体，总长度为2,743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ'基因。

pGEM-3Z含有两个来自噬菌体开启子，即T7开启子和SP6开启子，它们为RNA聚合酶附着作用提供了特异性识别位点。因为这两个开启子分别位于lacZ'基因中多克隆位点区两侧，故若在反应试管中加入纯化T7或SP6RNA聚合酶，所克隆外源基因便会转录出对应mRNA。质粒载体pGEM-4Z和pGEM-3Z在结构上基本相同，二者之间差异仅仅在于SP6和T7这两个开启子位置交换、取向相反而已。第95页第96页大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体，含有两种分别来自大肠杆菌和酿酒酵母复制起点与选择标识。它使研究工作者能够自如地在这两种不一样寄主细胞之间往返转移基因，并单独或同时在两种寄主细胞中研究目标基因表示活性及其它调整功效。比如，可将酵母某种基因亚克隆到穿梭质粒载体上，置于大肠杆菌中进行定点突变处理后，再把突变体基因返回到酵母细胞，方便在天然寄主中观察研究此种突变功效效应。大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体第97页5.3.3

λ噬菌体载体

噬菌体是一类细菌病毒总称，英文名叫作Bacteriophage，起源于希腊文“phagos”，如同质粒分子一样，噬菌体也能够用于克隆和扩增特定DNA片段，是一个良好基因克隆载体。作为细菌寄生物噬菌体，它能够在脱离寄主细胞状态下保持自己生命，但一旦脱离了寄主细胞，就既不能生长也不能复制，因为大多数噬菌体只能利用寄主核糖体、合成蛋白质因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖。第98页我们将只含有溶菌生长周期噬菌体叫作烈性噬菌体。而溶源生长周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA被整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它一个组成部分。含有这种溶源周期噬菌体，叫作温和噬菌体。以噬菌体DNA分子作载体，克隆含有目标基因外源DNA片段，假如没有造成主要噬菌体基因失活，那么当这种重组噬菌体DNA分子感染了寄主细胞之后，插入外源DNA片段便会伴随噬菌体DNA分子一道增殖。用放射性同位素32P标识特异性探针作噬菌斑放射自显影杂交，能够十分敏感地检测出含有这种重组体DNA分子噬菌斑（即阳性斑点）。取得了阳性噬菌斑之后，我们就可按照类似于制备质粒DNA方法，分离到大量重组体噬菌体DNA，实现克隆基因扩增。第99页

噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不一样类型。第100页λ噬菌体整个基因组可分为三个部分①左臂：从A到J长约20kb，其中基因编码组成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要蛋白质。②中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需序列。③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最主要调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需。

第101页在λ噬菌体线性双链DNA分子两端，各有一条由12个核苷酸组成彼此完全互补5‘单链突出序列，即通常所说粘性末端。注入到感染寄主细胞内λ噬菌体线性DNA分子，会快速地经过粘性末端之间互补作用，形成环形双链DNA分子。随即在DNA连接酶作用下，将相邻5’-P和3‘-OH基团封闭起来，并深入超盘绕。这种粘性末端结合形成双链区段称为cos位点（cohesive-endsite，粘性末端位点.第102页5.3.3.1.

插入型载体

外源DNA克隆到插入型λ载体分子上，就会使噬菌体某种生物功效丧失效力，即所谓插入失活效应。依据插入失活效应特异性，插入型λ载体又能够深入被分为免疫功效失活和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活两种亚型。(1)免疫功效失活插入型载体。这类载体基因组中有一段免疫区，其中带有一两种限制性核酸内切酶单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时，就会破坏载体所含有合成功效性阻遏物能力，妨碍其进入溶源周期。所以，凡带有外源DNA插入λ重组体都只能形成清楚噬菌斑，而没有外源DNA插入亲本噬菌体就会形成混浊噬菌斑。这种形态学上差异，为分离重组体分子提供了方便标志。(2)β-半乳糖甙酶失活插入型载体。许各种载体基因组中含有大肠杆菌lacZ区段，编码β-半乳糖苷酶基因lacZ。由这种载体感染大肠杆菌lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和X-gal培养基平板上，会形成蓝色噬菌斑，但在克隆过程中，假如外源DNA插入到lacz区段上，阻断了β-半乳糖苷酶基因lacZ编码序列，那么由这种重组体感染lac-指示菌，因为不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成无色噬菌斑。第103页5.3.3.2.

替换型载体

替换型载体又叫作取代型载体（substitutionvector）是一类在λ噬菌体基础上改建、在其中央部分有一个能够被外源插入DNA分子所取代DNA片段克隆载体。在构建这类载体时，安排在中央可取代片段两侧多克隆位点是反向重复序列，所以当外源DNA插入时，一对克隆位点之间DNA片段便会被置换掉，从而有效地提升了克隆外源DNA片段能力。第104页

“cosmid”一词是由英文“cossite-carryingplasmid”缩写而成，其原意是指带有粘性末端位点质粒。所以我们说，所谓柯斯质粒其实是一类由人工构建含有λDNAcos序列和质粒复制子特殊类型质粒载体。在柯斯质粒载体pHC79中，除cos位点之外，其两侧还含有与噬菌体包装相关λDNA短序列。质粒DNA部分则是一个完整复制子，包含一个复制起点和两个抗菌素抗性基因ampr和tetr。很显著，pHC79柯斯质粒兼具了λ噬菌体载体和pBR322质粒载体两方面优点，其克隆能力为31~45kb，而且能够被包装成为含有感染能力噬菌体颗粒。5.3.4柯斯质粒载体第105页用限制性内切酶处理质粒和噬菌体，再将cos位点拼接到质粒上再酶切位点将重组质粒线形化，再插入对应基因组DNA

经过含有氨苄青霉素选择性培养平板筛选存活细胞可能含有对应重组质粒第106页第一，含有λ噬菌体特征。柯斯质粒载体在克隆了适当长度外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，能够高效转染对λ噬菌体敏感大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后柯斯质粒DNA分子，能按照λ噬菌体DNA一样方式环化。第二，含有质粒载体特征。柯斯质粒载体含有质粒复制子，所以能像质粒DNA一样在寄主细胞内进行复制，而且能在氯霉素作用下，取得深入扩增。另外，柯斯质粒载体通常也都含有抗菌素抗性基因，可供作重组体分子表型选择标识，其中有一些还带上基因插入失活克隆位点。第三，含有高容量克隆能力。柯斯质粒载体分子仅含有一个复制起点，一两个选择记号和cos位点等三个组成部分，其分子量较小，普通只有5~7kb左右。所以，能够插入到柯斯质粒载体上并能被包装成λ噬菌体颗粒最大外源DNA片段，即柯斯质粒载体克隆极限可达45kb左右。柯斯质粒载体特点：第107页

pBluescript是专用商品名称，系指由Stratagene企业发展一类从pUC载体派生而来噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。

SK表示多克隆位点区一个取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI方向转录；（+/-）表示单链噬菌体f1复制起点两种相反取向。f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因有意义链DNA；而f1（-）起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因无意义链DNA。5.3.5

pBluescript噬菌粒载体第108页(i)

在多克隆位点区（MCS）两侧，存在一对T3和T7噬菌体开启子，用以定向指导插入在多克隆位点上外源基因转录活动；(ii)

同时含有一个单链噬菌体M13或f1复制起点和一个来自ColE1质粒复制起点，确保pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染不一样情况下，按照不一样复制形式分别合成出单链或双链DNA；(iii)

编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆选择标识；(iv)

含有一个lacZ基因，能够按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体重组子。第109页5.4基因分离与判定克隆：多细胞高等生物个体水平上:表示由含有相同基因型同一物种两个或数个个体组成群体，所以说，从同一受精卵分裂而来单卵双生子（monozygotictwins）便是属于同一克隆。在细胞水平上:指由同一个祖细胞（progenitorcell）分裂而来一群遗传上同一子细胞群体。基本步骤：(1)用于基因克隆DNA材料选择以及DNA分子片段化；

(2)外源DNA片段与载体分子体外连接反应；

(3)将人工重组DNA分子导入它们能够进行正常复制寄主细胞；

(4)重组体分子转化子克隆选择或筛选。第110页第111页第112页克隆基因分离1、

应用核酸探针分离克隆目标基因2、应用mRNA差异显示技术分离克隆目标基因3、应用cDNA差示分析法克隆基因4、应用酵母双杂交体系克隆基因5、基因图位克隆法6、DNA微列阵技术进行基因克隆

第113页基因克隆第一步是要从试验材料中制备包含“目标基因”在内DNA片段群体，而且这个DNA片段群体必须包容整个基因组全部序列，DNA片段大小要适合于基因操作要求。最简单方法是利用限制性核酸内切酶消化供体基因组DNA，并直接将消化产物与载体分子相连接。这个被称为鸟枪法（shot-gunapproach）方法最显著缺点，是所形成重组体分子带有大小不一样插入片段。因为高等真核生物基因组庞大，按普通载体承受外源DNA插入能力（大约为1000~3000bp）计算，能产生几十万个大小不一样DNA片段，形成由几十万个大小不一样重组体分子组成克隆群体。要想从如此巨大群体中，选出带有目标基因克隆，显然是十分费事。为了克服上述困难，有些人提议采取局部双酶消化法，确保DNA产物大小在10-30kb左右，经过蔗糖梯度离心或制备凝胶电泳技术，得到分子量约为20kb随机群体并将其克隆到适当载体上。

5.4.1DNA片段产生与分离第114页5.4.2重组体DNA分子构建5.4.2.1.

外源DNA片段定向插入载体分子

若用两种不一样限制性核酸内切酶同时消化一个特定DNA分子，将产生含有两种不一样粘性末端DNA片段。所以，假如载体分子和待克隆DNA分子都是用同一对限制性核酸内切酶切割，那么，载体分子和外源DNA片段将按一个取向退火形成重组DNA分子，从而确保外源DNA片段定向插入载体分子。实际上，载体分子和外源DNA插入片段（或称供体DNA），并不一定总能产生出互补粘性末端，所以，有时采取平末端连接法或采取附加衔接物方法来提升平末端之间连接效率。第115页5.4.2.2.

最正确连接反应

为了使连接反应物中外源DNA片段都能插入载体分子形成重组DNA，必须设法阻止经限制性内切酶切割后线性载体分子本身再环化作用，以提升DNA片段插入效率。当前惯用碱性磷酸酯酶处理由内切酶消化产生线性载体分子，除去该DNA5'-P末端，而留下一个5'-OH基团。经碱性磷酸酯酶处理过线性载体分子，除非插入了外源DNA片段，不然就不再能够重新环化成有功效载体分子。在连接反应中，正确地调整载体DNA和外源DNA之间百分比，是能否取得高产量重组转化子一个主要原因。应用λ噬菌体或柯斯质粒作载体时，配制高比值载体DNA/供体DNA连接反应体系有利于重组分子形成。以柯斯质粒载体为例，因为只有当给体DNA片段两个末端都同柯斯质粒载体结合之后，才能被有效地包装。若使用质粒分子作为克隆载体，其重组体分子由一个载体分子和一个给体DNA片段连接环化而成，所以，当载体DNA与供体DNA比值为1时，有利于这类重组体分子形成。第116页第117页5.4.2.3.

重组体分子导入受体细胞路径转化（或转染转导、显微注射电穿孔原核细胞和酵母等低等真核细胞高等动物真核细胞第118页核生物基因组DNA十分庞大，而且含有大量重复序列。所以不论是采取电泳分离技术还是经过杂交方法，都难以直接分离到目标基因片段。这个问题能够经过由mRNA产生cDNA进行克隆而得以部分处理，因为尽管高等生物普通含有3-5万种左右不一样基因，但在一定时间阶段单个细胞或组织中，仅有15%左右基因得以表示，产生出约5000-10000种不一样mRNA分子。cDNA克隆基本过程是经过一系列酶催作用，使总poly（A）mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，组成包含全部基因编码序列cDNA基因文库。5.4.3cDNA基因克隆第119页

5.4.3.1.高质量mRNA制备

可应用PromegaPolyATtractmRNA分离系统分离多聚(A)mRNA。将用生物素标识寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连抗生物素蛋白，用磁场吸附经过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连mRNA。第120页IsolationofmRNARNA提取分离mRNA第121页5.4.3.2.反转录生成cDNA

可同时在反转录系统中加入寡聚（dT）及随机引物R6，以确保得到全长cDNA，应选取活性较高反转录酶及甲基化dCTP，确保所取得双链cDNA方向性。因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5'-methylC外源DNA，所以试验中常选取mcrA-mcrB-菌株。选取cDNA克隆这一试验方案时必须考虑到目标基因mRNA在特定生物体组织中含量问题。在组织和培养细胞中，各种mRNA含量是极不相同，有些mRNA含量十分丰富，每个细胞可拥有数千个拷贝，而有些mRNA含量很低，每个细胞只有几个拷贝。依据mRNA分子含量多寡，即我们所说丰富程度（简称丰度），能够将mRNA划分为高丰度、中丰度和低丰度三种不一样类型（表5-3）。第122页OligodT或随机引物

合成cDNA第一链合成cDNA第二链补平cDNA链末端第123页从表中看出低丰度mRNA，每个细胞仅有14个拷贝左右，其总量约占总mRNA30%，其中约有11,000个左右不一样种类mRNA。所以，为了取得一个能够代表全部低丰度mRNA序列cDNA基因文库，必须最低克隆数（理论值）应是11,000/0.30=~37000。但因为在试验中存在着取样上差异，有些序列轻易被克隆，有些序列却不轻易被克隆，为了确保基因文库中能够包含全部序列，就必须增加克隆数目。为了使上述低丰度mRNAcDNA克隆到达99%期望率，大约需要筛选170,000个克隆。丰

度

等

级对应丰度等级mRNA群体占总mRNA百分数（%）在对应丰度等级中所含不一样种类mRNA序列数量（个）每个细胞所含对应丰度mRNA序列拷贝数（个）高丰度22303,500中丰度491,090230低丰度2910,67014第124页5.4.4克隆基因分离5.4.4.1.

应用核酸探针分离克隆目标基因

把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就能够与特异性核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交，方便筛选出含有目标基因阳性克隆，这个过程叫作克隆基因分离或筛选。应用核酸探针分离目标基因方法叫作核酸杂交筛选法。此法最大优点是应用广泛，而且相当有效，适合用于大规模筛选。只要有现成可用核酸探针，我们就有可能从任何生物体任何组织中分离目标基因，也就能够有效地检测任何一个插入外源DN