目的基因的连接、转化、涂板培养-刘玥

目的基因的连接、转化、涂板培养生物化学与分子生物学教研室刘玥掌握目的基因的重组连接原理及方法。理解蓝白斑筛选鉴定的原理熟悉重组DNA分子转化受体细胞的基本思路和方法目的实验总设计分---PCR分离目的基因切接---目的基因与载体相连转---转入宿主细胞筛---筛选阳性重组体接---目的基因与载体相连原理：DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个或者几个A碱基的特性利用T载体3’末端的T碱基和PCR产物的A碱基互补配对,经连接酶作用,完成与载体的连接是一种高效克隆PCR产物（TACloning）的专用载体。由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。pMDTM18-TVector

pMDTM18-TVector仪器与主要试剂：pMDTM18-TVector（TaKaRa公司）PCR扩增产物T4DNA连接酶10×T4DNA连接酶缓冲液

反应体系pMDTM18-TVector连接试剂盒使用说明（TaKaRa公司）① ②pMDTM18-TVector0.5μl 0.5μlPCR扩增产物4.5μlControlInsertDNA1μlddH2O 3.5μlSolutionI 5μl 5μl总体积10μl10μl16℃反应30-60分钟感受态细胞感受态细胞：经过电击、CaCl2、RuCl等化学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态。转---转入宿主细胞实验原理

---CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。实验器材器材：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪。

1.LB琼脂固体和液体培养基。2.含特定抗生素的LB固体培养基。3.100mMCaCl2溶液。4.含15%甘油的0.05mol/LCaCl2:称取0.28gCaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。5.待转化质粒。试剂实验步骤1.挑取一DH5α单菌落于2.5mlLB培养液中37℃过夜培养

2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间3.取50ml菌液置于离心管内，4℃4500g离心5分钟4.加入30ml,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟5.4℃4500g离心5分钟收集细胞后，加2ml,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。6.感受态细胞分装成100μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。取其中一份进行转化。7.向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上放置30分钟。8.将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。9.向管内加入800ul的LB培养液。然后37℃培养45分钟。生长培养基10.取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟选择培养基11.倒置平板于37℃培养12－16个小时。实验流程感受态细菌100ul连接产物10ul冰浴中30′混匀420C水浴90′′冰浴1-2′加入500

lLB培养液370C振荡培养45′涂板培养过夜勿动热激＋实验注意事项为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度:细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。

原理：

pMDTM18-TVector含有编码β-半乳糖苷酶基因（LacZ基因）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，不影响功能。当这种载体转入的宿主细胞是含有β-半乳糖苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列可以互补（称为α互补），产生具有酶活性的蛋白质（β-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有IPTG（强诱导剂）,X-gal（生色底物）的培养基上呈蓝色。然而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，破坏原有的阅读框，因此同样情况下，带重组质粒的细菌形成白色菌落。筛---筛选阳性重组体蓝白斑试验（IPTG-Xgal试验）lacZβ-半乳糖苷酶分解乳糖iPO调控蛋白P大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统a-互补显色反应（蓝白斑筛选）l