流式细胞术在血液学中的应用

髓过氧化物酶〔MPO〕是一种血红蛋白，它由两条53kDa重链和两条15kDa轻链组成，其分子量为140kD。每一个MPO分子包含两个起催化作用的非朊基卟啉。

MPO储藏于中性粒细胞的嗜天青颗粒中。MPO是中性粒细胞杀菌系统中的主要成分，它能催化氯离子〔Cl-〕和过氧化氢〔H2O2〕生成强氧化剂次氯酸〔HOCl〕。在许多炎症反响中，MPO被释放到细胞外，作为反映中性粒细胞活性的一个指标。激活的白细胞分泌MPO，其产生的过氧化物在宿主防御中起重要作用。MPO与动脉粥样硬化等心血管疾病密切相关，MPO影响粥样斑块稳定性及血栓形成，MPO促进氧化脂类〔具细胞毒及促凝血作用〕产生，同时耗竭NO引起血管收缩。

激活白细胞释放的MPO，在敏感的斑块中高表达并且具有催化活性，被认为是影响斑块的稳定性的一个重要因素。MPO可作为预测急性冠脉综合症〔ACS〕指标。

血浆MPO水平可以在不考虑C反响蛋白及其它的炎症标志物的情况下独立预测心血管疾病的危险性，血浆MPO水平可以预测急性局部胸痛病人6个月内患心肌堵塞及其他严重心血管疾病的危险性。更重要的是，对于肌钙蛋白I〔TroponinI〕及肌钙蛋白T〔TroponinT〕等经典检测排除心梗的患者，检测MPO水平可以预测这些病人发生心梗等严重心血管疾病的危险性。

单一的血浆MPO检测能独立预测早期心肌堵塞的危险性，及在随后的1至6个月内发生严重心血管疾病的危险性。与检测TroponinI、TroponinT、CK-MB、C反响蛋白水平不同，MPO检测可预测无心肌坏死的患者发生严重心血管事件的危险性，突出了它在预测胸痛病人出现心梗危险性的潜在作用。一、流式细胞术在根底血液学中的应用〔一〕血细胞的计数和分类研究

1．红细胞的计数、分类及其功能的研究

〔1〕循环的红细胞总量的测定：

生物素—逆转抗生物素蛋白—FITC系统的特异性和流式细胞

仪〔FCM〕的敏感性结合起来，建立了FCM测定人红细胞总量的方法，此方法具有标本用量少，无放射性的优点，适用于儿童和孕妇测定循环红细胞总量。

〔2〕网织红细胞总数：

外周血网织红细胞计数〔百分数和绝对值〕是一反映骨髓红系增生活性的常用指标。许多学者先后提出应用FCM和不同的RNA特异性荧光染料自动计数网织红细胞的方法，如派假设宁Y、AO、溴化乙啶、thiazole

orange等。

目前最普遍应用的是

thiazoieorange

染色法，这种特异性RNA

的激发波〔488nm〕测量的特点，与人工计数法相比，它不但能得到网织红细胞的百分数和绝对值，而且还能获得网织红细胞成熟指数〔RMI〕。RMI是一个检测骨髓功能的独立实验室指标，它与网织红细胞内RNA含量成正比，RMI可成功地用于评价骨髓移植的效果。

目前，FCM检测网织红细胞主要用于

1〕预测骨髓移植的效果；

2〕解释各种红系增长低下性贫血的发病原因;

3〕评价某些新的重组生物制剂的治疗效果。

2．白细胞计数、分类及其功能的研究

〔1〕白细胞计数和分类

FCM方法防止常规染色过程中，由于细胞漂洗和分类溶解所致的人工假象，提供了可靠的评价血液状态的第一手资料，并进一步筛选细胞亚群、测定其他参数。LDS-751、CD45、thiazole

orange

〔2〕中性粒细胞的功能

FCM可在单个细胞水平上定量测定中性粒细胞的功能变化，有助于了解白细胞在感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性疾病的作用和诊断意义。

〔3〕血小板功能的研究：

FCM可检测血小板膜抗原，如CD41a、CD42b、CD36、CD62p、CD63等。应用流式细胞术检测这些单克隆抗体的变化可用于：

a、评价血小板功能状态;

b、探测循环血液中激活的血小板;

c、探测血小板自身抗体。

如对原发性血小板减少性紫癜、慢粒急变和再障病人的血小板自身抗体的检测中发现，病人均可探测到IgM型自身抗体，有的病人可同时伴有IgM或IgA自身抗体，后者血小板减少更明显。因此，IgG血小板免疫荧光检查是检测自身免疫反响的敏感和特异指标，它可直接测定自身免疫性血小板减少病人的血小板外表免疫球蛋白，进行血小板交叉配型，以此为有自身免疫反响的病人选择适宜的供血者。

〔二〕正常骨髓各系血细胞特点的研究

1．造血干细胞的特点：

FCM多参数分析可以探测常规形态检查方法不能确认的造血干细胞。

2．红细胞系统的特点：

FCM系统地观察了红系统外表特异性抗原〔Hle-1、CD71和Glycophorin

A〕核酸及红细胞体积的变化来研究红系在正常骨髓分化成熟的规律。Glycophorin

A常作为红细胞晚期的特征，出现在有核红细胞，此时可与体积相似的淋巴细胞进行鉴别，Glycophorin

A在成熟红细胞到达最大值，不再随红细胞的成熟而变化。CD71表达介于Hle-1和Glycophorin

A之间，在Glycophorin

A出现之前，到达最大值。Hle-1主要表达在最早期可鉴别的红细胞上，随着红细胞的成熟而逐渐减少，红系随着成熟细胞体积逐渐减少的物理特点，可由FCM的前向散射光来测得。另外，在CD71和Glycophorin

A成熟红细胞中，DNA含量逐渐减少，以至只含有RNA，失去CD71成为成熟红细胞。

3.粒细胞的特点

〔1〕区别正常粒细胞和白血病克隆；

〔2〕确定白血病是以粒系为主，还是以单核细胞为主；

〔3〕探测粒细胞白血病的异质性。

4.巨核细胞的特点

应用FCM同时观察巨核细胞的体积，内部结构，DNA含量以及膜外表抗原在细胞分化成熟中的变化。

5.正常骨髓B细胞的分化和成熟

Ⅰ期：CD19、CD34、HLA-DR、TdT、CD10、Ig基因重排

Ⅱ期：失掉CD34、核TdT，CD10减弱，HLA-DR强度增加4倍，

同时表达HLA-DP和CD45

、CD19

Ⅲ期：CD20、HLA-DQ、SigM、CD19

Ⅳ期：CD19、CD21、CD22，不表达CD10

6.正常骨髓浆细胞的特点

两群：一群体积较小，表达CD22、CD35和SigE，是早期浆细胞。

另一群体积较大，膜抗原表达有明显异质性。

7.正常骨髓细胞DNA含量与细胞表型

S期：红系>粒系>单核系>淋巴系

淋巴系统中，S期的T细胞百分率明显低于B细胞二、流式细胞术在血液病学中应用〔一〕白血病的分类研究

B-cell

ALL

1.TdT

positive.

2.CD10

positive,

except

for

progenitor

B-cell

ALL.

3.HLA-DR

positive.

4.CD19

frequently

present

without

CD20.

5.Positive

cytoplasmic

μ

chain

in

pre-B-cell

type

only.

6.Monoclonal

surface

immunoglobulin

in

L3

only.

7.Immunoglobulin

gene

or

T-cell

receptor

gene

rearrangement.

T-cell

ALL

1.Positive

TdT.

2.Usually

negative

CD10

and

HLA-DR

(more

frequently

positive

in

adult

T-ALL).

3.CD7

is

frequently

the

only

positive

T-cell

marker,

but

all

T-cell

markers

can

be

present.

4.T-cell

receptor

gene

rearrangement.

Acute

Myeloblastic

Leukemia

without

Maturation

(M1)

1.Greater

than

90%

of

myeloblasts

in

the

bone

marrow.

2.Greater

than

3%

MPO-positive

blasts

in

the

bone

marrow.

3.Blasts

positive

for

CAE.

4.Blasts

positive

for

CD33/CD13,

HLA-DR.

5.Blasts

negative

for

CD14,

CD15,CD41/CD61,glycophorin.

6.Immunoglobulin

and/or

TCR

gene

arranged

in

mixed-lineage

leukemia.

7.Specific

cytogenetic

abnormalities:

t(9;22)(q34;q11)

and

inv(3)

(q21;q26).

Acute

Myeloblastic

Leukemia

with

Maturation

(M2)

1.30-90%

of

myeloblasts

present

in

bone

marrow.

2.Less

than

20%

monocytic

precursors

in

the

bone

marrow

3.Less

than

5×10

9

/L

monocytic

precursors

in

the

peripheral

blood.

4.Cytochemical

stain

for

blasts:

Positive

for

myelo-peroxidase

and

chloroacetate

esterase

but

negative

for

α-naphthyl

butyrate

esterase.

5.Monoclonal

antibody

panel:Positive

for

CD13,CD15,CD33,HLA-DR,but

negative

for

CD14.

6.Specific

cytogenetic

abnormality:

t(8;21)(q22;q22).

Acute

Promyelocytic

Leukemia

(M3)

1.Presence

of

more

than

30%

hypergranular

(or

hypogranular)

promyelocytes

in

the

bone

marrow.

2.Presence

of

multiple

Auer

rods

in

the

cytoplasm

of

leukemia.

3.Cytochemical

staining:

Strongly

positive

for

myeloperoxidase

and

chloroacetate

esterase,

but

negative

for

a-naphthyl

butyrate

esterase.

4.Immunophenotypeing

:

Positive

for

myelomonocytic

antigens

(CD13,CD15,CD33),negative

for

monocytic

antigen

(CD14)

and

HLA-DR.

5.Abnormal

karyotype

:

t(15;17)

detected

by

cytogenetic

or

molecular

biological

techniques.

6.Coagulation

work

up:

Decreased

platelets

and

fibrinogen;

prolonged

prothrombin,

activated

partial

thromboplastin

and

thrombin

times,

and

increased

levels

of

fibrin

degradation

products.

Acut

Myelomonocytic

Leukemia(M4)

1.Presence

of

at

least

30%

myeloblast-monboblasts

in

bone

marrow.

2.Monocytic

component

:

More

than

20%

but

less

than

80%

in

bone

marrow.

3.If

monocytic

component

is

less

than

20%

in

the

bone

marrow.

A.Monocyte

count

in

peripheral

blood

should

be

greater

than

5×10

9

/L.

B.Serum

lysozyme

concentration

should

exceed

three

times

the

normal

value.

4.Myeloblasts

:More

than

20%

in

bone

marrow.

5.Myeloperoxidase

positive

cells

:

More

than

3%.

6.Chloroacetate

esterase

and

a-naphthyl

butyrate

esterase-positive

cells:

Roughly

more

than

20%

each.

7.Abnormal

chromosome

16

in

M4

:

Associated

with

M4

EO

subtype.

8.Immunophenotype

:

Positive

for

CD13,CD14,CD15,CD33,and

HLA-DR

,negative

for

CD41/CD42/CD61

and

glycophorin

A.5a:

80%

or

more

of

monocytic

components

are

monoblasts.

B.M5b:

Predominantly

monocytes

and

promonocytes.

2.Elevation

of

serum

and

urine

lysozyme

levels.

3.Cytochemistry:

Myeloperoxidase

:

may

or

may

not

be

positive.

Nonspercific

esterase

:

strongly

positive

.

Specific

esterase

and

periodic

acid-Schiff:

usually

negative

.

4.Immunophenotype

:

Positive

for

CD11c,CD13,CD14,CD15,CD33,HLA-DR,negative

for

CD41,

CD42,

CD61

and

glycophorin.

5.Cytogenetics

:

Association

with

t/del(11)(q23).

Acute

Megakaryoblastic

Leukemia

(M6)

1.Presence

of

at

least

50%

erythroblasts

among

all

nucleated

cells

in

the

bone

marrow.

2.Presence

of

at

least

30%

myeloblasts

among

all

nonerythroid

cells

in

the

bone

marrow.

3.PAS

positivity

in

all

mature

and

immature

nucleated

erythroid

cells.

4.Glycophorin-A

antibody

or

other

erythroid

antibodies:

The

only

reliable

antibody

for

phenotyping.

5.React

variably

to

myelomonocytic

(CD13,CD33)

and

platelet

(CD41)

antibodies.

6.Most

frequent

cytogenetic

abnormalities:

-5/5q-

,-7/7q-

.

Acute

Megakaryoblastic

Leukemia

(M7)

1.Presence

of

30%

or

more

megakaryoblasts

in

the

bone

marrow.

2.Excess

of

blasts

with

increased

numbers

of

maturing

megakaryocytes

in

bone

marrow

biopsy

,

plus

identification

of

megakaryoblasts

in

the

peripheral

blood

and

bone

marrow

aspirate

by

immunologic

techniques.

3.Electron

microscopic

identification

of

platelet

peroxidase

in

leukemic

cells.

4.Monoclonal

antibodies

:

CD41,CD42,and

CD61

are

specific

for

megakaryoblastic.

5.Myelomonocytic

markers

:

Positive

for

CD33

but

negative

for

CD13,CD14

and

CD15.

6.PAS

Staining

pattern

in

megakaryocyte-megakaryoblasts

:

Periphery

of

cytoplasm

and

concentrated

on

cytoplasmic

blebs.

7.t(1;22)(p13;q13):

Specific

for

M7

infants.〔二〕白血病细胞动力学

1、不同类型急性白血病细胞动力学差异不大。

2、RNA含量与细胞增殖活性呈正相关，G1期细胞DNA含量高于G0期。RNA高的细胞具有较高的增殖能力。

3、治疗前RNA高的急性白血病，化疗效果好，缓解期较长；RNA含量越低，那么更多的细胞处于G0期，化疗效果差，不易缓解。一旦获得缓解，缓解期相当长。

4、DNA非整倍体是恶性细胞的标志，但急性白血病的DNA非整倍体检出率低于实体肿瘤。

〔三〕预测化疗效果和微小残留病变〔MRD〕

1、小剂量阿糖胞苷〔Ara-C〕由于阻断DNA的合成而使S期增高；

2、小剂量阿糖胞苷〔Ara-C〕由于杀死S期细胞而使S期减少；

3、应用FCM动态观察化疗前后细胞动力学参数的变化，发现化疗有效者，化疗后S期和RNA

指数下降比无效者明显，且S期恢复较快。

4、MRD是白血病复发的根源。

〔1〕DNA非整倍体监测化疗效果；探测1%-3%残留白血病细胞；有DNA非整倍体的缓解期白血病多在三个月内复发。

〔2〕检测白血病相关抗原

CALLA+/TdT+

抗原监测急淋或TdT+/CD5+抗原监测T细胞急淋。

〔3〕运用FCM分选感兴趣细胞分子水平的研究，如PCR、FISH等。

〔四〕其他恶性血液病的应用

1.骨髓增生异常综合征〔MDS〕

〔1〕依细胞动力学特点可分为RA、RARS、RAEB、CMML。

〔2〕低S期者预示生存期短。

〔3〕DNA非整倍体可作为MDS转化为白血病的早期指标。

2.慢性淋巴细胞白血病〔CLL〕

〔1〕外表Ig荧光强度弱是CLL的特点，借此区别慢性淋巴细胞性淋巴瘤和幼稚淋巴细胞性白血病。

〔2〕慢淋的细胞动力学特点是骨髓和外周血的S期低〔0.2〕，而淋巴结的S期却高达60%。其RNA含量低于正常淋巴细胞，通常难以发现DNA非整倍体。

3.慢性粒细胞白血病〔CML〕

〔1〕CML是一种累及多种细胞系的白血病。

〔2〕90%以上CML

Ph+，借此可探测MRD。

〔3〕CML急变时，可发现DNA非整倍体，急粒变时RNA升高，急淋变时RNA

下降。

〔4〕CML细胞动力学与正常造血细胞没有明显差异。

4．淋巴瘤

〔1〕大多数低危淋巴瘤的DNA多为二倍体或近二倍体。

〔2〕滤泡性淋巴瘤为近二倍体或近四倍体。

〔3〕弥漫性大细胞淋巴瘤多为高二倍体，Burkitt淋巴瘤为二倍体或高二倍体。

〔4〕滤泡性淋巴瘤主要表达B细胞标志，但不表达CD5，可区分滤泡性淋巴瘤白血病和CLL，区别Burkitt淋巴瘤〔SIgG+，CD10-〕和小细胞无核裂淋巴瘤〔SIgG+，CD10+〕。

〔5〕何杰金氏病多为二倍体，增殖活性不高，10%病人可为四倍体或高四倍体，伴有较多R—S细胞〔CD15+、CD30+〕。

5．骨髓瘤

骨髓瘤是干细胞疾病，其DNA非整倍体探测率高于其他恶性血液病〔60%-80%〕，增殖活性低，RNA含量高，这些参数在不同类型的骨髓瘤中有一定预后意义。

〔五〕分选造血细胞

分选细胞是FCM的又一重要功能，目前主要用于：

〔1〕骨髓移植，去除自身