(高清版)GBT 41712-2022 脱氧核糖核酸酶I 酶活及杂质检测方法

脱氧核糖核酸酶I酶活及杂质检测方法2022-10-12发布I l2规范性引用文件 13术语和定义 14试剂或材料 l5仪器设备 26试验步骤 27质量控制 5Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG11)提出并归口。本文件起草单位：福建南生科技有限公司、夏禾(深圳)生物技术有限公司、深圳市中鼎检测技术有限公司、苏州坤琪生物科技有限公司、蚌埠产品质量监督检验研究院、南京诺唯赞生物科技股份有限公司、西安国联质量检测技术有限公司、福建华灿制药有限公司、上海鹰姿生命科技有限公司、雷谷(厦门)生物医药有限公司、北京中天标科标准化技术研究院有限公司、复旦大学、厦门致善生物科技股份有限公司、山东大学、安琪酵母股份有限公司、上海楚豫生物科技有限公司、武汉科技大学、中国计量科学研究院计量与分析科学研究所、厦门艾德生物医药科技股份有限公司。脱氧核糖核酸酶I(DNaseI,EC3.1.21.1)是最有代表性的核酸内切酶，降解单链和双链DNA,产生具有5'-磷酸末端的分解物，在一般条件下其分解产物含有单核苷酸或8个～12个碱基的寡核苷酸，平均大小约4个核苷酸。制定脱氧核糖核酸酶I国家标准，用以推动该类工具酶的产业化，对于脱氧核糖核酸酶I的生产和使用具有重要意义。1脱氧核糖核酸酶I酶活及杂质检测方法1范围本文件描述了脱氧核糖核酸酶I酶活及杂质的检测方法。本文件适用于脱氧核糖核酸酶I酶活及杂质的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。脱氧核糖核酸酶deoxyribonuclease水解脱氧核糖核酸(DNA)中磷酸二酯键，生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶。脱氧核糖核酸酶IdeoxyribonucleaseI水解单链和双链DNA,产生具有5'-磷酸末端的单核苷酸或寡核苷酸(8个～12个碱基)的核酸内切酶。脱氧核糖核酸酶I活力单位activityunitofdeoxyribonucleaseI以小牛胸腺DNA为底物，在25℃、pH5.0的溶液中，在260nm处每毫升每分钟变化0.001吸光度值为一个酶活性单位(kunitzunit)。杂质impurity影响底物的其他核酸内切酶或核酸外切酶。4试剂或材料符合GB/T6882规定的二级水。4.21mol/L醋酸钠缓冲液精密称取8.2g无水乙酸钠，溶于水中，用5mol/LHCl,调至pH5.0,混匀后，定容至100mL。24.30.1mol/L硫酸镁溶液精密称取1.2g无水硫酸镁，溶于水中，混匀后，定容至100mL。4.40.85%氯化钠溶液精密称取0.85g氯化钠，溶于水中，混匀后，定容至100mL。4.5小牛胸腺DNA溶液精密称取33mg小牛胸腺DNA,用冷水定容至100mL,置4℃过夜溶解。4.60.1%酵母RNA溶液精密称取0.1g酵母RNA,用0.1mol/L醋酸钠缓冲液溶解并定容至100mL。取固体或液体待测供试品适量，用冷的0.85%氯化钠溶液溶解并稀释。5仪器设备6试验步骤6.1酶活性检测6.1.1底物溶液按表1配制底物溶液并进行标定：用0.85%氯化钠溶液作空白对照清零，取底物溶液2.5mL,加入0.5mL0.85%氯化钠溶液，混匀后在紫外分光光度计中测定波长260nm处的吸光度值A₂6o应为0.60±0.05,否则应调整小牛胸腺DNA的加样量。表1底物溶液的配制试剂1mol/L醋酸钠缓冲液0.1mol/L硫酸镁溶液纯化水总体积6.1.2酶促反应(25℃)按表2配制酶促反应液，混匀后立即置紫外分光光度计中测波长260nm处的吸光度值A26,每分钟读数一次，共计3次，取相邻两个读数差值△A26o/min的最大值。△A2o/min的最大值应在0.067~3GB/T41712—20220.083之间，否则需调整供试品的稀释度。表2酶促反应配制表试剂供试品/mL对照品/mL底物溶液供试品 0.85%氯化钠溶液总体积6.1.3酶活性计算6.1.3.1单位体积中酶活性按式(1)计算。…(1)式中：Upv——酶活性每单位体积，单位为酶活性单位每毫升(kunitzunit/mL);A₄——△A2sn/min的最大值；3——酶促反应液的总体积，单位为毫升(mL);0.5——酶促反应液中供试品的加样量，单位为毫升(mL);d₁——稀释倍数；0.001——260nm处每毫升每分钟变化0.001吸光度值。6.1.3.2单位固体质量中酶活性按式(2)计算。式中：Ups——酶活性每单位质量，单位为酶活性单位每毫克(kunitzunit/mg);Upy——酶活性每单位体积，单位为酶活性单位每毫升(kunitzunit/mL);C₄——供试品的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)。6.2RNase杂质检测6.2.1溶液配制6.2.1.1溶液1:13.61g三水合乙酸钠、800mL纯化水，用2mol/L乙酸调pH5.0,定容至1L。6.2.1.2溶液2:0.1g酵母RNA、100mL溶液1,溶解30min。6.2.2供试品溶液6.2.2.1溶液E:取固体/液体待测供试品适量，用冰预冷的纯化水溶解并稀释。6.2.2.2溶液E。:将溶液E;稀释2倍。6.2.3RNase活性检测6.2.3.1水解速率测试(E₀)用纯化水作空白对照，按表3配制水解速率测试反应液，混匀后立即在25℃条件下在线检测，每分4GB/T41712—2022表3水解速率测试(Eo)反应液配制表试剂测试1/mL空白/mL溶液2纯化水0.200.150.10总体积用纯化水作空白对照，按表4配制总水解度测试反应液，混匀后立即在25℃条件下在线检测，每分钟读数一次，共计20min,E;值为△Aso/min≤0.002时的读数。表4总水解度测试(Er)反应液配制表试剂测试/mL空白/mL溶液2—— 纯化水 总体积式中：S——每分钟(E。-E;)对数直线斜率；E。——水解速率测试值；E;——总水解度测试值；△t——反应时间10min。式中：Ups——RNase活性每单位质量，单位为酶活性单位每毫克(kunitzunit/mg);S——每分钟(E。-Er)对数直线斜率；3——反应液的总体积，单位为毫升(mL);V₀——速率测试(E。)中酶的加样体积，单位为毫升(mL);C₄——供试品的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)。6.2.4RNase杂质含量按式(5