PCR技术及其应用课件

PCR技术及其应用生物化学实验技术1精品ppt目录PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例2精品ppt

多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。3精品ppt体内DNA的复制体系DNA聚合酶（IIIIII）拓扑异构酶解旋酶类SSB

引物dNTPMg2+5’3’4精品pptMullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段5精品pptTaq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020耐热DNA聚合酶Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。6精品pptPCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸7精品pptPCR的指数扩增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火变性、退火延伸8精品pptTaqP1P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1+P2DNA聚合酶：TaqE原料：dNTP反应缓冲液10xBuffer辅助因子：Mg2+9精品ppt1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

PCR反应条件10精品ppt（2）引物浓度

0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq

DNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。11精品ppt（4）dNTP（10mMor2.5mM）含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP

dNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。12精品ppt（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。浓度为0.5-2.5mmol/L。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。13精品ppt2）循环参数变性

使双链DNA解链为单链

94℃，

30-60秒(2)退火

温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。14精品ppt引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。Tm=（G+C）x4+（A+T）x215精品ppt（3）延伸

70-75℃,一般为72℃延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数

主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加16精品pptPCR的应用

1、特定DNA片段（基因、调控序列）的鉴定、分离或制备。A、DNAB、cDNA2、基因表达分析（原位、离体）A、基因是否表达B、基因表达水平高低3、基因突变17精品ppt基因克隆（ＲＴ－ＰＣＲ）逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂交双链PCR扩增18精品ppt1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达原位ＰＣＲ分析基因表达的组织特异性19精品ppt荧光定量PCR（real-timePCR)分析基因表达水平

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。内掺式染料 SYBRGreenI序列特异性探针 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特异性探针

Amplifluor(Intergen)20精品ppt5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

21精品ppt反向PCR(reversePCR)扩增已知序列两侧的未知序列

用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。

未知序列未知序列已知序列22精品ppt已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶23精品ppt实时荧光定量PCR仪梯度PCR仪普通PCR仪24精品ppt25精品ppt1、材料：含0.3Kb插入片段的克隆载体2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管琼脂糖凝胶电泳设备3、试剂：10XPCR 反应缓冲液25mmol/LMgCl2

10mmol/LdNTP10μmol/L引物1和引物2二、实验材料、仪器和试剂26精品ppt1.反应体系（50µl体系）：10XPCR反应缓冲液25mmol/LMgCl2

10mmol/LdNTP10μmol/L引物110μmol/L引物2模板DNATaqE补充水三、操作步骤10XB10XP1P210XT10XE

27精品ppt2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀：

三、操作步骤10XBuffer2.5μL10XP12.5μL10XT2.5μL10XE2.5μL25μL水12.5μL10XP22.5μL28精品ppt3.PCR扩增程序：

94℃5-10min（预变性）94℃30S55℃30S72℃30S72℃5-10min（后延伸）4℃保温30Cycles29精品ppt屏幕显示方式30精品pptMainRunEnterListEditFileLid运行已有程序已有程序菜单删除已有程序新建反应程序编辑已有程序热盖关闭调节31精品pptEnterEnter

abcdefghi#

jklmnopqr#

Name#stuvwxyz#

InUse!.,-+/():=#

Enter

PCR1

ControlMethod

BLOCKSim-Tube

输入文件名,满8个字符自动生成程序名,不满8个字符时用#终止BLOCK:屏幕显示样品台温度(样品台温控方式)Sim-Tube:屏幕显示反应液温度(模拟管温控方式)Enter

PCR1

Segment#1

HoldCycleEND

选择预变性保温32精品ppt循环内第一步温度和时间Enter

PCR1

Holdat94C

Holdfor5m0s预变性温度和时间Enter

PCR1

Segment#2

HoldCycleEND

3stepPCR循环参数设置Step#1

94.0CHold0m30s循环内步骤数33精品pptStep#1

Option？

Noyes不需要拓展功能Step#2

55.0CHold0m40s循环内第二步温度和时间Step#2

Option？

Noyes不需要拓展功能Step#3

72.0CHold0m30s循环内第三步温度和时间34精品ppt不需要拓展功能设置循环数后延伸保温后延伸温度和时间Step#3

Option？

NoyesTotalCycle=35Segment#3

HoldCycleENDHoldat72.0C

Holdfor10m0s35精品pptSegment#4

HoldCycleEND选择反应完后保温Holdat4.0C

Holdfor99m0s设置反应完后的保温温度和时间Segment#5

HoldCycleEND终止参数设置EnterPCR1

EstimatedRunTime：

1h53m05s

Save？YESno预计反应时间，程序是否保存36精品pptLidLID

Turnoffheated

Lidbelow9C当温度低于9度时，热盖自动关闭37精品pptRunPCR1

PCR2RUNPCR1

Useheatedlid?

YesNoRUNPCR1

Vessel:0.2T