原生质体的分离培养与细胞培养-原生质体的分离培养

原生质体培养与体细胞杂交

——原生质分离培养

主讲人：姜放军湖南生物机电职业技术学院植物组织培养技术工作任务原生质体的培养及活力鉴定任务3对向日葵下胚轴和子叶的原生质游离任务1原生质体融合及融合体的培养

任务4融合体的选择及杂种细胞进行鉴定

任务5

对获得的原生质体纯化任务2原生质体存活率测定原生质体纯化原生质体培养原生质体融合融合体培养原生质体分离融合体的选择杂种细胞鉴定原生质体培养和体细胞杂交基本流程及常用方法实践知识一、向日葵下胚轴和子叶的原生质体分离（酶解法）

（一）无菌苗培育

选取仔粒饱满日葵种子去壳后,消毒将消毒的种子接种于不含任何激素的MS固体培养基上。置于暗处发芽,温度为(26±1)℃。（二）酶液的配制

酶液Ⅰ组成：纤维素酶酶液Ⅱ组成：纤维素酶（三）原生质体分离(一步分离法)

取前面培育的无菌苗，用刀片切下下胚轴后撕去表皮，纵剖若干细条，再横切成2～3mm小段放入酶液Ⅰ中。撕去叶片的小表皮，切成小块放入酶液Ⅱ中。每10mL酶液中约放2g材料，在26℃下酶解3～4h，其间摇动几次。

（四）向日葵下胚轴原生质体的纯化（漂浮法）漂浮法：是指应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面，来进行原生质体纯化的方法。

向日葵下胚轴原生质体的纯化具体方法步骤如下：

1.将酶解后的向日葵下胚轴原生质体用200目不绣钢网过滤，除去未解离的组织，再用22%的蔗糖溶液冲洗网上残渣（蔗糖溶液体积与酶液相等）。

2.滤液（即酶液和蔗糖液）装入离心管，以600r/min离心3～6min。

3.待原生质体漂浮后吸去下面的液体及残渣。4.加入17%蔗糖溶液6～8ml，混匀后离心（600r/min，5分钟），吸去下面的液体及残渣，重复一次。5.加入1～2ml0.16mol/LCaCl2•2H2O（加1%MES，pH=5.8），使原生质体的密度在2103g/ml条件下悬浮，以备后面进行原生质体培养和融合之用。

（五）向日葵子叶原生质体的纯化（界面法）界面法：是指选用两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液密度小于原生质体的密度，原生质体即介于两种溶液之间，从而对原生质体进行纯化的方法。

原生质体分离及纯化

一、原生质体分离双子叶外植体胚性细胞（一）材料来源多数植物分离原生质体的经典材料-----叶肉细胞。问题探究

禾本科植物：愈伤组织或悬浮细胞。供体材料的重要性

供体材料是影响原生质体培养能否成功的关键。理论上植物的各种器官、组织和细胞都可作为分离原生质体的供体材料，但目前常用叶片、分裂旺盛和再生能力强的愈伤组织及悬浮细胞系，尤其是胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系是最理想的原生质体分离材料。（二）分离方法机械分离法酶法分离法最初用的是机械分离的办法，但是效率极低。英国科学家Cocking于1960年利用酶.降解去细胞壁的办法从番茄根尖分离了大量的原生质体，成为现在广泛使用的方法。首先对外植体进行预处理有两种方法：低温处理：外植体放在4℃下，黑暗中1-2天。等渗溶液处理：外植体放在等渗溶液中数小时。1、机械分离法优点：

（1）能排除酶的有害影响；

缺点：

（1）原生质体的产量低；

（2）方法繁琐费力；

（3）液泡化程度低的细胞也不能采用,此方法局限性大步骤：使细胞质壁分离→切开细胞壁→获得原生质体。（1）确定酶的种类纤维素酶类（Cellulase）果胶酶类（Pectolyase）半纤维素酶类（Hemicellulase）崩溃酶蜗牛酶2、酶法分离（Enzymaticisolation）

植物细胞膜和细胞壁的构成：细胞膜：脂类、蛋白质细胞壁：初生壁（纤维素、半纤维素、果胶、量结构蛋白）、次生壁（纤维素、半纤维素）两个相邻细胞的初生壁之间有胞间层。（2）酶液的配制酶的配比及浓度渗透压稳定剂及pH（3）分离原生质体一步法：外植体放入酶液，真空泵抽引渗透处理、26℃摇床振荡2-8小时方法有二：

叶肉原生质体分离提纯两步分离法一步分离法两步法：果胶酶处理材料、游离出单细胞、纤维素酶处理单细胞、分离出原生质体优点：所获得的原生质体均匀一致、质量好；缺点：操作复杂，已被淘汰。图示一步法原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心加果胶酶和纤维素酶原生质体纯化与活力测定（一）原生质体纯化方法三种离心沉淀法漂浮法界面法

纯化原因：上述酶处理后的混合物含有：未消化组织、破碎细胞和原生质体。所以，必须对得到的混合液体进行纯化，以得到纯净的原生质体。问题探究1、离心沉淀法

原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤，除去未消化的组织细胞。第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此2-3次。第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。沉降法的优点：纯化收集方便，原生质体丢失少；目前被广泛采用。缺点：原生质体纯度不高。2、漂浮法原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。步骤：第一步：400目网筛过滤。第二步：离心。第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀。2-3次。第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。漂浮法的优点：原生质体纯度高。缺点：原生质体收率低。3、界面法(不连续梯度法)

原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液

步骤离心管中配制成不同的浓度梯度加入原生质体混合液离心5min，原生质体位于某一浓度梯度，用吸管收集液体培养基。悬浮洗涤原生质体2-3次将原生质体悬浮在液体培养基中备用优点：获得的原生质体大小均匀一致，纯度高；

缺点：操作繁琐，原生质体收率低。（二）原生质体活力测定1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。2、染色识别

1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。

2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。影响原生质体培养的因素原生质体活力原生质体起始密度：过低过高均不利渗透压稳定剂：常用甘露醇培养基成分培养条件：初期培养是暗培养植物种类

原生质体培养一、培养基pH渗透压钙镁生长物质氮源碳源培养基

（1）碳源

葡糖糖是最佳碳源，蔗糖单独使用效果较差，与葡萄糖配合使用效果较好。碳源的作用一是保持细胞渗透压，另一方面是作为细胞分裂时的能源物质和组成原料。（2）氮源

适当浓度的谷氨酰胺有利于原生质体的的细胞再生、分裂、生长。NH4+浓度太高不利于原生质体的培养，有毒害作用，在马铃薯上已有研究证明。（3）生长物质

生长素和细胞分裂素是细胞分裂分化所需要的通常物质，原生质体培养也需要这些生长调剂。但不同植物对生长调节剂的浓度要求不同。（4）钙镁

研究指出在原生质体培养中增加Ca2+的浓度。可增强原生质体的稳定性，提高原生质体的分裂能力率。明显改变细胞内外的离子交换。（5）渗透压

最常用的渗透调节剂是山梨醇和甘露醇，两者常结合在一起配合使用。现在很多人用葡萄糖代替糖醇。（6）pH及灭菌

一般pH为5.6-6.0之间，培养基偏酸不利于与原生质体的培养。（7）常用培养基：MS、B5、N6.2、养条件培养温度25-27度，光照16h/d左右，静置为主，但为了不使细胞集聚，最初几天需要经常轻轻摇动，以助通气。有些材料不需要光照，所以依材料而定培养条件。3、与同种材料的不同基因型二、培养方法培养方法液体浅层培养平板培养法双层培养法饲养层培养法原生质体悬浮液1mm厚液体培养基2x105/ml1、液体浅层培养2、平板培养

原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖（37

C左右）等体积混合成0.7%，培养于培养皿中。3、双层培养法（固、液培养）

培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。固体培养基4、饲养层培养方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.7%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。方法二：X-射线杀死原生质体，与0.7%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.7%琼脂混合，培养于饲养层上。4、饲养层培养1、细胞壁再生：原生质体培养后1-2天即可合成完整细胞壁，只有形成完整细胞壁的细胞才能进入细胞分裂。2、细胞分裂、愈伤组织或胚状体形成3、植株再生途径：（1）通过愈伤组织形成不定芽；该途径占多数。（2）原生质体再生细胞直接形成胚状体。植株再生问题探究第一次分裂第二次分裂第三次分裂