DNA重组技术的工具

DNA重组技术的基本工具专题1-11怪物12怪物23怪物34怪物45思考：以上这些构想，传统的育种方法能否实现？6这就要用到定向改造生物的新技术

——基因工程7基因工程：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。操作对象：操作水平：结果：DNA重组技术和转基因技术分子水平基因重组操作环境：主要技术：原理（变异类型）人类需要的生物类型和生物产品基因生物体外8苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。

苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉为什么能把苏云金芽孢杆菌的基因“嫁接”到棉花上并成功表达？1、所有生物的的DNA都是以4种脱氧核苷酸为基本单位，构成独特的双螺旋结构，这为不同生物DNA拼接提供了物质基础。2、地球上的所有生物共用一套遗传密码。9基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)重组DNA导入形成10基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞11解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限制性核酸内切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1.1、DNA重组技术的基本工具12一、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）原核生物这类酶存在于原核生物中有什么作用呢？1、主要来源：

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，限制酶是一种防御工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，使之失效，保证自身的安全。为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？13即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。3、作用机制：4000种。2、种类：

因为含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或不具备这种限制酶的识别序列，或通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。14限制酶特点：专一性作用部位：磷酸二酯键15（1）黏性末端被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。4、结果：形成两种末端黏性末端平末端16

EcoRⅠ黏性末端黏性末端17

EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开18SmaⅠ平末端（2）平末端平末端SmaⅠ能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端

当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。19GAATTCCGTAGAATTCGGATT尝试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTCTTAAGGCATCTTAAGCCTAACTTCATGAATTCCCTAA

GAAGTACTTAAGGGATT练一练:GGCATCTTAAAATTCCGTAG目的基因20

被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？思考:要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。是，会产生相同的黏性末端。21

DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制酶切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。22分子缝合针：DNA连接酶

G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GGC

TT

AA

AA

TT

C

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同种限制酶切割23二、分子缝合针──DNA连接酶

1、作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。24AATTGCCTTAAG连接磷酸二酯键25

可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键2、类型26

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶27类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别28DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板29三、基因的运输工具——运载体3.种类：质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒。1.作用：将外源基因送入受体细胞。能在宿主细胞内复制并稳定地保存。具有一个至多个限制酶切点，使外源基因插入其中。具有某些标记基因，以便进行筛选。如抗菌素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。对受体细胞无害，不影响其正常活动。2.条件：30质粒病毒(噬菌体和动植物病毒)31最常用的运载体——质粒分布：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中。最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。本质：细胞染色体(或拟核)外能自主复制的小型环状DNA分子。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。32基因的运输工具——质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。3334小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4

DNA连接酶运载工具具备的条件结构简单,大小适中能在宿主细胞中自我复制并稳定存在具一个多个限制酶切位点具标记基因质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒351、质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是①能自主复制②不能自主复制③结构很小④蛋白质⑤环状RNA⑥环状DNA⑦能“友好”地“借居”A．①③⑤⑦