植物组培快繁程序

植物组培快繁程序第三章植物组培快繁程序

植物快速繁殖就是应用组织培养技术,快速繁殖名优特新品物，使其在较短时间内繁衍较多的植株。快繁是当前植物细胞组织培养中应用最广泛，又最有效的方法之一。一、供体植株的培养与取材二、外植体的灭菌与接种三、培养四、驯化移栽五、组培快繁计划安排与实施主要内容一、供体植株的培养与取材

一般来说，无论何种类型的细胞组织培养技术，起始阶段均涉及外植体取材、灭菌与接种培养等基本过程。外植体来源的环境以及外植体的类型，均会影响将来培养的效果，而灭菌、接种和培养条件的选择与控制，也与外植体的来源和类型有关。1、外植体的来源-生长在自然环境下的植物-有目的地培育在温室控制条件下生长的植物-无菌环境下已经过离体培养的植物自然环境中生长的植株，一般带有微生物，甚至与某些微生物具有寄生关系，使植株具有内生菌。取自这些植物的外植体，在培养过程中会有微生物滋生，从而影响培养效果。

自然环境生长植株温室控制条件下生长植株已离体培养植株

在多数情况下，应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物材料作为外植体来源，减少培养过程中的微生物感染概率。同时，生长在控制条件下的植物可以保持培养材料间的一致性，提高实验的可重复性，也便于培养技术的规范。

某些多年生植物或特殊材料，必须取自自然生长的植物，就需要尽可能避免使用那些生长过于潮湿和不洁净环境中的植物。对于培养过程中可能出现内生菌污染的材料，应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始培养的材料。

2、供体植株的管理取自室外的外植体材料，供体植株的管理十分重要，这与外植体培养时的污染率密切相关。植株管理中应注意：⑴避免昆虫危害许多昆虫如蚜虫、螨类和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介，会引起植物组织的潜在感染。⑵注意防病尤其是真菌和细菌病害的侵染，取自感病植株的外植体，在培养中的污染率远远高于来自健康植株的外植体，必要时需使用化学药剂防治病害。⑶控制湿度给供体植株浇水时应从根部给水，避免从上部浇水，以免上部形成易于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室湿度；取材前尽可能保持植株干爽。3、材料取材⑴材料选择培养材料应选择有代表性的主要植物、选择性状优良的种质或特殊的基因型。快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，如花药培养应在花粉发育到单核期取材。⑵取材从生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官和组织。最好采用茎尖，后代性状较稳定，携带细菌较少。选取材料的大小一般在之间。胚胎培养或脱毒在0.5cm以下。材料太大易污染，材料太小难于成活。

1、预处理先对植物材料进行修剪整理，去掉不需要部分，将准备使用的植物材料（外植体）在流水中冲洗20-60分钟，备用。如特别不洁的外植体，可先用加有洗涤剂的水清洗10-15分钟，再用流水冲洗干净。二、外植体的灭菌与接种2、表面灭菌（1）操作人员穿戴灭过菌的工作服、口罩。进入接种室前双手用洗涤剂清洗干净，操作前再用70%酒精或消毒剂擦洗双手。（2）操作期间双手和台面常用70%酒精或消毒剂擦拭。超净工作台使用前必须用紫外灯照射杀菌，然后开启风机。

（3）接种用工具（解剖刀、剪刀、镊子）可放入70-75%酒精中，使用时需火焰灼烧灭菌，冷却后使用。（4）外植体放入超净工作台内，置70-75%酒精中5-60秒，0.1％氯化汞6-10分钟，或10%的漂白粉上清液中10-15分钟，然后用无菌水冲洗3-5次。灭菌时需进行搅动。

常用灭菌药剂的使用和效果

灭菌剂使用浓度（%）清除的难易消毒时间效果次氯酸钠9—10易5—30很好次氯酸钙2易5—30很好漂白粉饱和浓度易5—30很好氯化汞0.1—1较难2—10最好酒精70—75易0.2—2好过氧化氢10—12最易5—15好溴水1—2易2—10很好硝酸银1较难5—30好抗菌素4—50mg/L中30—60较好（1）材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含l—2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。（2）解开包口纸，将培养瓶口几乎水平拿着，避免灰尘落入瓶中。使瓶囗靠近酒精灯火焰，并将瓶口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。3、外植体的接种（3）迅速用镊子夹取切割分离下的所需组织、细胞、器官，送入培养容器内，轻轻插入培养基。若是叶片直接附在培养基上，以放1—3块为宜。接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。然后及时盖上瓶盖或封口。注意：所有操作均应严格保持瓶口在操作区以内，且不远离酒精灯；工具用后应及时灭菌，避免交叉污染；工作人员操作时禁止不必要的谈话。三、培养

指把离体植物材料放在培养室(有光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。1、培养含义2、培养方法(1)固体培养法即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。(2)液体培养法即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50～100r/min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。

培养步骤初代培养继代培养生根培养3、培养步骤（1）初代培养目的：获得无菌材料和无性繁殖系。无性繁殖系：是指由一个外植体继代增殖，繁殖出的具有相同遗传物质的植株群体。包括：芽丛、不定芽、胚状体、原球茎等。培养基：诱导或分化培养基。培养基中CTK多，IAA少。类型（根据发育方向）：丛生芽增殖型器官发生型胚状体发生型原球茎发生型

根、芽胚状体根、芽愈伤组织芽根

芽外植体试管苗★

原球茎根、芽

外植体成苗途径根类型方式事例丛生芽增殖型腋芽萌发，以芽增殖芽，扩大繁殖系数甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹器官发生型通过脱分化形成愈伤组织，再分化出苗烟草、油菜等胚状体发生型从愈伤组织或直接从子叶、下胚轴和花药培养中产生甘蔗、胡萝卜、石刁柏等原球茎型由茎尖或腋芽产生原球茎放入培养基中发育成小植株兰花球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起（球茎芽），一端出芽一端出根观叶海棠块茎型叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分化出芽和根花叶芋鳞茎型鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎百合、郁金香、贝母等孢子型用成熟或未成熟的孢子进行培养地钱、狼尾蕨等根茎型蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组培的最佳外值体肾蕨、裂叶肾蕨、波士顿蕨等微枝扦插型带芽的小插条在试管内进行无菌扦插葡萄、杨树顶芽腋芽丛生芽增殖型Ⅰ微型扦插顶芽CTK刺激带芽的茎切段侧芽接种培养形成的茎梢节长，直立向上呈小灌木丛状获得较多嫩茎梢茎段培养继代扩繁试管苗生根培养无愈伤组织产生初代继代丛生芽增殖型Ⅱ器官发生型Ⅰ脱分化分化愈伤组织芽、芽丛切割芽丛继代培养大量芽丛试管苗生根培养外植体初代继代器官发生型Ⅱ①②愈伤组织培养

愈伤组织具分裂能力的细胞已分化细胞脱分化继代

愈伤组织分裂诱导期

分裂期

分化期愈伤组织诱导◆双子叶植物>单子叶植物和裸子植物◆

幼年细胞和组织>成年细胞和组织◆

二倍体细胞>单倍体细胞◆

根据培养目的选取外植体愈伤组织诱导◆

外植体大小一般为0.5cm的圆柱形或方形块◆添加植调剂和天然提取物利于诱导和维持◆生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色或浅绿色或绿色，老化的多为黄色或褐色脱分化因植物种类、器官及生理状况有大差异：◆禾谷类植物脱分化较难。◆细嫩组织脱分化较易；成熟组织较难。◆花器脱分化较易；茎叶难。诱导期◆诱导期长短与植物种类、生理状态有关。◆诱导期长短与环境因素有关。

母株生长在弱光下的外植体易于诱导，分裂频率高。

增加O2和迅速释放CO2利于细胞分裂。◆添加植调剂诱导分裂效果好。◆合成代谢迅速。分裂期特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。分化期特征：形成瘤状结构的外表和内部分化；出现多种类型的细胞。石龙芮下胚轴培养产生胚状体过程体细胞胚状体发生型Ⅰ

外植体愈伤组织小孢子游离单细胞器官

胚状体

试管苗体细胞胚状体发生型Ⅱ胚状体形成植株的特征：1.具两极性

2.胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系

3.胚状体的维管组织的分布是独立的“Y”形

4.数量多，速度快，结构完整，成苗率高原球茎：缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。原球茎发生型1.初代培养时外植体发育途径有几条？2.正常的愈伤组织一般为何种颜色？其诱导有何特点？思考题：目的：扩繁无根苗（生产上边扩繁边生根）。扩繁方法：以几何级数增加，可切割茎段，分离芽丛、胚状体、原球茎。培养基：基本培养基或分化培养基实质：增殖培养物。（2）继代培养（3）壮苗和生根培养◆生根培养基：1／2或1／4MS基本培养基；不加或少加CTK，适量添加NAA；糖浓度1-1.5%。◆培养条件：增加光强，达3000-10000lx。◆壮苗

◆生根方法与途径①新梢基部浸入50或100ppmIBA液4－8h；②在含IAA类培养基中培养4－6d；③移入含活性碳的生根培养基培养。⑤其它方法④生根困难的则在培养基中搭滤纸桥或按①生根其它方法

延长在增殖培养时间

降低增殖倍率，减少CTK用量

对易生根植物，切割粗壮嫩枝在营养钵中直接生根

胚状体发育成小苗不经生根阶段，但需壮苗生根

接种只是完成了离体培养的第一步，植物离体培养和栽培植物一样，生长过程中也受到各种环境因素的影响。培养条件是离体培养能否成功的关键。在培养基条件适宜的基础上，影响试管苗生长的主要因素有光照、温度、湿度、氧气。（4）培养条件光照1）光强★影响外植体细胞的增殖、组织和器官的分化。一般培养室的光照强度要求1000～5000lx。★愈伤组织的诱导有的在光照下有促进作用；光照强，幼苗生长健壮；光照弱，幼苗生长弱小，容易徒长。★不同波长的光对细胞的分裂和器官的分化有影响。2）光质②白光促进小花天竺葵愈伤组织的生长，蓝光则无作用。如：①红光促进杨树愈伤组织的生长，蓝光阻碍其生长。3）光照时间根据植物生物学特性决定；光照长短对试管内花的形成是个重要影响因素，一般给予周期性光照比较好。多数植物8-10小时黑暗为宜。光周期长短因植物种类而异。在胡萝卜组织培养中随着日照长度的增加，而促进生长。

1）大多数植物23-32℃，一般控制在25±2ºC。低于15

C或高于35

C，对生长都是不利的。

2）植株种类及外植体的不同，其最适温度也是不同的。如百合20℃；月季25－27℃；番茄28℃。

△

温度湿度1）瓶内的湿度：一般为100％，主要受到培养基含水量和封口膜透性的影响。如培养基过硬，则不利于外植体接触和插入培养基，导致生长迟缓；封口膜过于透气，也会使瓶内湿度下降。

湿度过低会使培养基丧失大量水分，渗透势升高，影响材料对营养物质的吸收，也会阻碍外植体的生长。湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。一般为70－80%。2）环境湿度：1）培养基适宜pH值5-6.5，一般为5.8，调整用0.1M的NaOH和HCl溶液。pH值2）ｐH影响培养基的硬度。ｐH＞6.5培养基会变硬；ｐH＜5.0培养基不易凝固。3）灭菌之前，培养基的pH要比标准提高0.2－0.3个单位。气体(必要条件)1）培养瓶内氧气的充足与否与封口材料有关。可用棉塞或特制的封口塑料。通气最好的是棉塞，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。2）培养基内氧气充足与否与培养基的种类和培养方式有关。◆固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。◆液体培养时，可考虑采取振荡培养的方式，以增加通气性。

2）２个大气压以上就对生长有阻碍作用，5～６个大气压生长就完全停止，６个大气压细胞就不能生存。渗透压1）1-2个大气压促进生长。复习思考题：1.继代培养有何意义？其目的和实质是什么?2.组培苗生根方法有哪些？3.外植体成苗途径有几条？四、驯化移栽高温且恒温

高湿

弱光

无菌1、试管苗生态环境与自然环境的差异▼

2、试管苗的特点

生长细弱，角质层不发达光合作用差叶片气孔数少，活性差根吸收功能弱对逆境的适应性和抵抗能力较差3、试管苗的驯化

目的：提高试管苗的适应性，促其健壮，最终提高移栽成活率原则：★从温、光、湿度及有无杂菌等环境因素考虑。★驯化开始数天内，与培养环境条件相似；后期与预计栽培条件相似，逐步适应。方法：即炼苗。不开口自然光下2-3天，然后开口1-2天。试管苗的移栽方法Ⅰ

组培驯化移栽常用基质组培驯化移栽用穴盘试管苗的移栽方法Ⅱ试管苗的移栽

移栽方法：取出试管苗，全部轻洗去培养基栽入基质(事先浇透水)后，栽后轻浇薄水，移入高湿环境(90%以上)。移栽场所：日光温室塑料大棚驯化室注意：1.保持小苗水分供需平衡2.防止菌类滋生3.给予一定温光条件4.注意基质配比并保持适当的通气性1）保持小苗水分供需平衡

1周内：

环境高湿，遮光。

1周后：

小苗生长后逐渐降湿，拱棚两端通风。

半个月后：

揭膜，控水，增加光强。▼

2）防止菌类滋生

◆基质高压灭菌或3h烘烤灭菌或太阳能灭菌。◆适当使用杀菌剂、消毒剂。◆移栽时少伤苗。◆喷水加0.1%尿素或1/2MS大量元素液追肥，加快苗生长。3）给予一定温光条件

适宜生根温度：18－20℃，温度低可加地热线。移栽初期弱光，后逐渐加强光照，过渡到自然光照。

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◆保持基质通气性：选颗粒状基质，浇水勿多。4）注意基质配比并保持适当的通气性▼

◆基质配比：珍：蛭：草(腐殖土)=1：1：0.5珍：草(腐殖土)=1：1

提高试管苗移栽成活率的途径？1、壮苗移栽比弱苗移栽成活率高2、生长素（NAA）利于生根3、低无机盐浓度生根效果好4、活性炭利于嫩茎生根5、避免太阳直射，温度25-30℃，湿度在85%以上6、使试管苗逐渐从无菌向有菌过渡组织培养工厂化育苗生产流程简图

五、组培快繁计划安排与实施

商业化生产规模的确定应以市场需求为标准，否则试管苗难以销售，造成经济损失。

外植体的入瓶；器官形成及增殖；试管小植株出瓶等试管苗生产过程均是在无菌条件下进行的，因此，试管苗生产规模可以用无菌工作台的数量来衡量的。1.试管苗生产规模的确定

一般一个单人无菌工作台可年生产10万～15万株苗，一个1.2m×0.6m×2.0m的6层培养架可年繁殖1.5万～2万株试管苗。年产100万株的组培苗生产工厂，需8～10个无菌工作台，培养架40～50个。接种室面积应为40～50m2，培养室面积则为100～120m2。

培养容器的数量取决于生产规模，一个6层培养架(1.2mX0.6mX2.0m)可放置900个左右三角瓶或360个左右兰花瓶，还需增加10％～15％的周转用培养容器。

驯化室可内装喷灌设施和可移动苗床。每平方米苗床可栽种800株试管苗，一茬苗的过渡周期为30d，年产100万株苗的过渡培养室，建造面积应为400~600m2。2.试管苗增殖率的估算Y=xn年增殖率全年增殖周期数n=365/每