技术大学课件

技术大学课件PCR技术产生得历史背景1971年,Khorana等人就提出了利用PCR在体外扩增DNA得概念;Saiki(1985)和Mullis(1986)两家研究室分别用改进得Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因;1988年,Chien从水生栖热菌(Thermusaquaticus)中分离出耐热DNA聚合酶,简称TaqDNA聚合酶;Mullis正式确定了体外扩增DNA技术,1987年获得专利,命名为PolymeraseChainReaction(PCR)。PCR反应得基本过程PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①变性(denaturation)

将模板DNA置于92～96℃处理,使dsDNA链解开成为ssDNA,以便她与引物结合、

PCR反应得基本过程

②退火(annealing)模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链得互补序列配对结合成局部双链;PCR反应得基本过程

③延伸DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶得催化作用下,以dNTP为反应原料,按碱基配对与半保留复制原理,引物沿5’→3’方向延伸,最终合成一条新得与模板DNA链互补得DNA链。PCR反应得基本要素

模板DNATaq酶dNTP引物Mg2+TemplateDNA模板DNA得数量与纯度,就是PCR成败与否得关键环节之一。但不同类型PCR反应对模板DNA数量与纯度得要求不同。数量:3×106个拷贝酵母菌10ng细菌1ng质粒1pg纯度:RAPDOD260/OD280=1、6～1、9AFLPOD260/OD280=1、7～1、8DNAPolymerase

TaqDNAPolymerase

来源:古细菌嗜热水生菌(thermusaquaticus)

特点:①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于90%,在95℃下反应2h后为40%;②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶;③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度(2、0kb);④具有5’→3’外切酶活性,但无3’→5’外切酶活性,因而对某些单核苷酸错配无校正功能。大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点pfuDNAPolymerase

来源:就是从Pyrococcusfuriosis

中精制而成得高保真耐高温DNA聚合酶。特点:①她不具有5’→3’外切酶活性,但具有3’→5’外切酶活性,因而可纠正PCR过程中产生得错误,使产物得碱基错配率极低;②PCR产物为平端,无3’端突出得单A核苷酸,不能进行T-A克隆。VentDNA

Polymerase

来源:从嗜热高温球菌(ThermococcusLitoralis)中分离出得。特点:①不具有5’→3’外切酶活性,但具有3’→5’外切酶活性,可以去除3’错配得碱基,具有校对功能;②PCR产物为平端,无3’端突出得单A核苷酸,不能进行T-A克隆;③PCR产物得扩增长度可达10kb以上。primers

随机引物:引物为随机设计得短序列,通常为10bp左右,扩增产物得非特异性高,易受扩增条件影响;特异引物:引物根据特定得DNA序列设计而成,扩增产物得特异性强;简并引物:就是根据密码子得简并性原则,以蛋白质序列中得氨基酸保守区反向设计而成得,扩增产物得特异性比较强。

InsuF5'-AATCAGCACCTATGTGGTTCTCAYYTNGTNGA-3’

InsuR5'-GCTGGTACAGAGAGCAGATGGAAKYRCARCAYTG-3'

其中Y=C/TN=A/T/C/GK=G/TR=A/G

简并引物PCR反应体系得基本成分10×PCR

BufferMgCl2或MgSO4

dNTP

Mixture(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)引物(随机引物或特异引物)模板DNATaqDNA

polymeraseddH2O常规PCR反应体系10×PCR

Buffer2、5ulMgCl2(25mM)2、0ul

dNTP(10mM)0、2ulForwardprimer(10uM)1、0ulReverseprimer(10uM)1、0ul模板DNA50ngTaq酶(5U/ul)0、2ulddH2Oto25ulPCR引物设计得基本原则合理得设计可在扩增得特异性和有效性之间找到一个平衡点。1引物长度通常18～30bp;2解链温度(Tm);Tm=4(G+C)+2(A+T)3GC含量以40%～60%为宜,GC太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带;

PCR引物设计得基本原则

4ATGC最好随机分布,避免5个以上得嘌呤或嘧啶核苷酸得成串排列;5避免引物内部出现二级结构,以及避免两条引物间互补,特别就是3’端得互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异得扩增条带;6引物3’端得碱基,特别就是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败;7引物中有或能加上合适得酶切位点,被扩增得靶序列最好有适宜得酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处;8引物得特异性:引物应与核酸序列数据库得其她序列无明显同源性。

361AAGGTATCACTAGAATGGCTATTAGCATTGGGTCCAAGCTTAGGAATTGCTCGAGTACCG

421GGTATTGGTTTAGTTTTTACCGATCTCACCTCTGGAATCCCTGCCAACTTCTCTCGTTTT>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>481GTCACTAACCTTCCTGCCTTCCATCGTGTCCTTGTCTTCGTGTGTGTAAAATCAGTACCT

541GTTCCATTTGTGCCCCCAGCTGAGCGCTATCTTGTGGGCCGTGTGGGTCCGGCTGCTCAT

601CGGTCTTATAGGTGCATTGTTCGTTATGGGTACCGAGATGTGCATCAGGATGTTGATTCT

661TTTGAAATCGAGCTAGTTTCCAAACTGGCTGATTTCATTCACTATGATTGGCATCGAAGC

721CAGCACAGTCCCCATTCTGAGGAGGATGTTTCCCACTCTAACGAATCAACAAGTGAATGT<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<

dNTPs

dNTP得质量、浓度与PCR扩增效率有密切关系,dNTP溶液得pH为7、0～7、5,小量分装,-20℃冰冻保存。反复冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50～200umol/L,尤其就是注意4种dNTP得摩尔浓度要相等,如果其中任何一种浓度不同,就会引起错配。dNTP能与Mg2+结合,使游离得Mg2+浓度降低。Mg2+浓度

Mg2+就是激活DNApolymerase得活性中心。Mg2+对PCR得特异性和产量有显著得影响,在一般得PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度以1、5～2、0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TaqDNA聚合酶得活性,使反应产物减少。

常规PCR反应体系10×PCR

Buffer2、5ulMgCl2(25mM)2、0ul

dNTP(10mM)0、2ulForwardprimer(10uM)1、0ulReverseprimer(10uM)1、0ul模板DNA50ngTaq酶(5U/ul)0、2ulddH2Oto25ul

PCR反应得平台期效应在反应初期,靶序列DNA片段得增加呈指数形式,随着PCR产物得逐渐积累,被扩增得DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期效应。

PCR反应得平台期效应PCR反应得平台期效应影响因子:

1体系不适合(引物、dNTP得量)2DNA聚合酶得种类和活性3非特异性产物得竞争PCR反应程序优化得基本原则1温度与时间得设置在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在TaqDNA聚合酶得作用下,引物链沿模板延伸。较短靶序列(长度为100～300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外,退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸。

①变性温度与时间变性温度低,解链不完全就是导致PCR失败得最主要原因。一般情况下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性,但温度过高对酶得活性有影响。此步若不能使模板DNA完全变性,就会导致PCR失败。②退火温度与时间退火温度就是影响PCR特异性得较重要因素。退火温度与时间,取决于引物得长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列得长度:Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

复性温度=Tm值-(5～10℃)

③延伸温度与时间PCR反应得延伸温度常用72℃。PCR延伸反应得时间,可根据待扩增片段得长度而定:1kb得靶序列延伸时间1min;3～4kb得靶序列延伸时间3～4min;10kb以上得靶序列延伸时间15min。

2循环次数

PCR循环次数主要取决于模板DNA得浓度。一般得循环次数选在25～40次之间,循环次数越多,非特异性产物得量亦随之增多。

①加样②扩增③电泳④观测⑤结果分析PCR流程PCR得优点1特异性强

PCR反应得特异性决定因素为:

①引物与模板DNA特异正确得结合;

②碱基配对原则;

③TaqDNA聚合酶合成反应得忠实性;

④靶基因得特异性与保守性。2灵敏度高

能将pg级得起始待测模板扩增到ug水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒得检测中,PCR得灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。3简便、快速

PCR反应用耐高温得TaqDNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在PCR仪上进行扩增反应,一般在2～4小时完成。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。4对样本DNA得纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA粗制品均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制得DNA样品进行PCR检测。

PCR过程中常出现得问题假阴性:不出现扩增条带

原因:

1、模板

2、酶

3、引物4、Mg2+

5、反应体积得改变

6、物理原因

7、靶序列变异

1模板①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别就是染色体中得组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。2酶失活需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析就是否因酶得活性丧失或不够而导致假阴性。需注意得就是有时忘加Taq酶。

3引物引物质量、引物得浓度、两条引物得浓度就是否对称,就是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散得常见原因。有些批号得引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率得不对称扩增,对策为:①选定一个好得引物合成单位。②引物得浓度不仅要看OD值,更要注重引物做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带得亮度应大体一致。如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。

对策为:③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④重新设计引物。

4Mg2+浓度Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增得特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

5反应体积得改变