组培苗生产技术-组培苗的培养与观察统计（植物组织培养课件）

外植体的离体培养技术

八、试管苗的增殖培养（一）继代培养中扩繁的方法1.切割茎段2.分离芽丛3.分离胚状体4.分离根状茎（二）继代培养中材料的接种方式1243（三）培养基成分及培养条件对继代培养的影响1.苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高

改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。

可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。

可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。3.分化率低,畸形,培养时间长时苗再次愈伤组织化

改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。

可能原因:生长素用量偏高,温度偏高。

改进措施：减少生长素用量，适当降温。

2.苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化4.叶粗厚变脆5.再生苗的叶缘、叶面等处偶有不定芽分化出来

可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。

改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基。

可能原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。

改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式。

6.丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽

改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，降低接种密度。可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。7.幼苗淡绿，部分失绿可能原因：无机盐含量不足，pH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好pH值，调控温度、光照。

改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。8.幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中可能原因：瓶内气体状况恶化，pH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当。外植体的离体培养技术

试管苗的生根培养

这一阶段的目的是使第二阶段通过腋芽生长和不定芽形成途径得到的嫩枝生根产生小植株，以便移栽。很多草本植物的不定根的形成是很容易的，但木本植物一般要困难些，其中从成年树得到的材料就更困难。由于生长的嫩枝本身含有丰富的生长素，所以一部分植物可在无激素的培养基上生根。

（一）生根培养基的要求：MS、B5、White等培养基，都可用于诱导生根，但是其含盐浓度要适当加以稀释；除White外，都富含N，P，K盐，它们都抑制根的发生。因此，应将它们降低到1／2，1／3或1／4，甚至更低的水平；生根培养基适当加大生长素的浓度，不用或少用细胞分裂素，生长素浓度在0.1-10mg/l，使用较多的是NAA，其次为IAA和IBA，生长素浓度过高时容易引起愈伤组织化和抑制根的生长；培养基中蔗糖的浓度降低到1.0-1.5%，以增强植株的自养能力；培养基不宜过硬以免影响生根；可在培养基中加入1%左右的活性碳，为提高小植株的光合能力；可将光强度增加到3000-10000lux，光周期可用24小时光照或16小时。（二）生根方法

①将新梢基部浸入IBA溶液中处理4-8h；②在含有生长素的培养基中培养4-6d；③直接移入含有生长素的生根培养基中。

上述三种方法均能诱导新梢生根，但前二种方法对新生根的生长发育则更为有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。其原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。不过这种方法比较可行。另外，也可采用下列方法生根：1、延长在增殖培养基中的培养时间；2、有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量(即将增殖与生根合并为一步)；3、切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，此方法则没有生根阶段。可以省去一次培养基制作，切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些容易生根的作物。4、少数植物生根比较困难时，则需要在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。5、嫁接到根系发达、抗逆性强的合适砧木上，如三倍体西瓜苗接到瓠子上，在25-30℃、饱和湿度条件下，三天伤口长出愈伤，一周可成活。组培过程中异常问题诊断与处理任务玻璃化问题及解决办法任务分析（相关知识点）反馈与评价拓展训练任务任务实施任务提出（玻璃化的诊断与防治）一、玻璃化现象当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明状，呈水迹状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。症状：叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状；整株矮化肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。三、防治措施（1）增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；（2）减少培养基中含氮化合物的用量；（3）增加光照；（4）增加容器通风；（5）降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；（6）降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。植物组织培养中常见的问题及解决办法反馈与评价根据要求完成任务,初步分析出培养过程中有哪些异常情况以小组为单位，提交工作总结报告（异常情况、原因及措施）ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.12ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.老师对各组的任务完成情况进行点评，最后对此任务完成情况依据工作考核标准进行评分3外植体的离体培养技术

七、愈伤组织增殖与分化愈伤组织定义脱分化，具有分化潜能，薄壁细胞团愈伤组织的特点：生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光泽；也有浅绿色或绿色；而老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。愈伤组织类型根据愈伤质地划分为：愈伤组织颜色有白、绿、黄和红色不同颜色的愈伤愈伤组织培养物在某些条件下，可以再分化产生不定芽或根的分生组织甚至是胚状体，继之，由这些有结构的组织而发育成苗或完整小植株。一、愈伤组织通过再分化形成再生植株的方式：主要有三种(1)先产生芽，后在茎的基部长根；2)先长根，再长芽；(3)愈伤组织的不同部位分别形成根和芽。1、器官的形成一般愈伤组织开始分化时，由大小不等的细胞开始逐渐形成大小均匀的细胞，保持相对稳定状态。在分化时，愈伤组织的表层和内部都可形成分生中心。芽多发生在愈伤组织的表层，属外起源。根发生在组织的深处，与整体植株发生类似，是内起源。愈伤组织的外部形态也随分化而改变，一般由疏松转向紧密。2、体细胞胚的发生愈伤组织体细胞胚植株3、激素对愈伤组织分化的影响植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为明显的，合适的植物生长物质配比在器官分化中起着重要的作用。如仙人掌科的金牛掌茎段培养中，当6-BA加倍时，茎段的愈伤组织可以再分化出仔球，而6-BA浓度过高(150倍)或过低(10倍)则无仔球形成。器官分化的植物激素控制理论大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论。生长素与细胞分裂素的比例小时则产生苗，比例大时则生根，而两种激素的比例适中时，则产生无结构的愈伤组织。THANKS感谢各位,请指导!@YourName组培过程中的异常情况诊断与处理植物组织培养中常见的问题及解决办法任务分析（相关知识点）反馈与评价拓展训练任务任务实施任务提出（组培异常现象的诊断与防治）细菌菌落呈黏液状，颜色多为白色，1～2d出现真菌菌落多为黑色、绿色、白色的绒毛状、棉絮状，3～10d出现任务污染问题及解决办法任务分析（相关知识点）污染一组织培养过程中的污染源户外风大菌类进屋机会多屋内太潮菌类繁衍多物品带菌多屋内不干净屋内清理带菌组培苗接种不正确任务污染问题及解决办法通风经常开窗，保持室内空气流通去湿保持室内空气干燥光照紫外线能杀灭或抑制真菌生长防霉污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷预防措施任务污染问题及解决办法若污染菌类是零星分散在培养基中人为引起材料带内生菌影响植物材料正常生长切口引起真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉。但若是细菌污染，因此只要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可以用。若是外植体，菌类从材料培养基以上部分长起，且发生在5天以后若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势污染材料用抗生素等杀菌药剂的处理污染原因判断及污染苗抢救任务污染问题及解决办法植物组织培养中常见的问题及解决办法将培养过程中的异常苗挑选出来，并拿笔记本做好记录工作前准备分成四组，每组将挑选出的异常苗进行诊断，经小组讨论拟出初步防治措施工作实施任务实施植物组织培养中常见的问题及解决办法反馈与评价根据要求完成任务,初步分析出培养过程中有哪些异常情况以小组为单位，提交工作总结报告（异常情况、原因及措施）ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.12ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.老师对各组的任务完成情况进行点评，最后对此任务完成情况依据工作考核标准进行评分3复习思考题

？

污染问题是植物组织培养中首先要解决的问题，对组培研究的成败有着至关重要的影响。结合你的实践经验，分析如何降低组培过程中污染现象的发生？外植体的离体培养技术

六、愈伤组织诱导培养

（一）培养基培养基一般包括大量元素、微量元素和一种碳水化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。这样简单的培养基(基本培养基)只有很少几种植物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要添加各种各样的附加物（完全培养基），如维生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、赤霉素、螯合剂如EDTA、各种营养性的提取物如椰子汁等。注意：选用完全已知的合成化合物，不大主张用复杂的天然产物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。必须强调：适合于诱发愈伤组织的培养基不一定适合于维持这些愈伤组织；适合于液体培养的培养基也不一定适合于固体培养。培养基中的N，大多数都用硝态氮，只有MS培养基和B5培养基中才用硝态和铵态的混合物。K的水平在近代的培养基中有逐渐提高的趋势。有趣的是，各种离子浓度大为不同的培养基往往能使相同的组织快速生长。例如Hildebrandt培养基与MS培养基显著不同，但二者都能培养烟草的愈伤组织。注意：激素的种类和用量的添加一般诱导愈伤常添加2.4-D（二）愈伤的培养方式：培养分为固体和液体培养两大类。液体培养又分静止和振荡培养的二类。继代培养（传代）：愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于养分的枯竭，水分的散失，组织代谢产物的积累，影响愈伤组织生长，因此必须将组织转移到新的培养基上。一般在25-28℃下进行固体培养时，每隔4-5周进行一次继代培养。组织块较小时，继代培养时可将整块组织转移。组织块较大时，可先将组织分成几小块再接种。继代培养必须及时进行，长期不传代常常由于代谢产物的累积，对组织起毒害作用，某些植物愈伤组织的褐化现象即往往由此引起的。褐化的愈伤组织反复地进行继代培养，可使愈伤组织恢复活力而迅速生长理论上愈伤组织是可以无限制继代，但愈伤组织继代次数增加，形态发生能力逐渐丧失。原因：遗传因素即继代培养中通常出现染色体紊乱。

遗传上表现不稳定：染色体出现多倍体和非整倍体组培过程中异常问题诊断与处理任务褐变问题及解决办法任务分析（相关知识点）反馈与评价拓展训练任务任务实施任务提出（褐变的诊断与防治）一、褐化现象

褐变——是指外植体在培养过程，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。（植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。）在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。褐变原理：褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。这些酚类化合物在完整的组织和细胞中，与多酚氧化酶是分隔存在的，因而比较稳定。但在建立外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分隔效应被打破，酚类化合物外溢。但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢紊乱，生长停滞不，最终衰老死亡。二、褐化的主要原因（1）品种：由于多酚氧化酶活性上的差异，有些品种的外植体在接种后较易褐变，而有些品种的外植体在接种后不易褐变。如一般木本植物，单宁、色素含量高的植物易发生褐变。核桃单宁含量很高，在进行组织培养时难度很大，不仅接种后的初代培养期发生褐变，而且在形成愈伤组织以后还会因为褐变而出现死亡。

（2）生理状态：一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。（幼龄材料酚类化合物含量少，而成龄材料比较多。

）（3）取材部位如苹果顶芽作外植体褐变程度轻，比侧芽容易成活。石竹和菊花也是顶端茎尖比侧芽茎尖更容易成活。油棕用幼嫩器官或组织，如胚等作为外植体进行培养，褐变较轻，而用高度分化的叶片作外植体，接种后则很容易褐变。总之，分生部位接种后醌类物质形成少；而分化部位接种后醌类物质形成多。（4）取材时期如24个苹果品种进行茎尖培养时发现，以冬春季取材褐变死亡率最低，其他季节取材则都有不同程度地加重。核桃的夏季材料比其他季节材料更易氧化褐变，因而一般都选在早春或秋季取材。造成这种季节性差异的原因，主要是由于植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶活性呈季节性变化，植物在生长季节都含有较多的酚类化合物之故。多酚氧化酶活性和酚类含量基本是对应的，春季较弱，随着生长季节的到来，酶活性逐渐增强，因而有人认为取材时期比取材部位更加重要。

（5）外植体大小及受伤害程度如金冠苹果茎尖小于0.5mm时褐变严重,当茎尖长度在5mm～15mm时褐变较轻,成活率可达85%。另外，取外植体时还要考虑其粗度，细的可切短些，粗的可切得长些。外植体组织受伤害程度直接影响褐变。为了减轻褐变，在切取外植体时，应尽可能减小其伤口面积，伤口剪切尽可能平整些。用椰子的完整胚、叶片作外植体进行培养，很少发生褐变。除了机械伤害外，接种时各种化学消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变。酒精消毒效果很好，但对外植体伤害很重；氯化汞对外植体伤害比较轻。一般来讲，外植体消毒时间越长，消毒效果越好，但褐变也越严重，因而，消毒时间应掌握在一定范围内，才能保证较高的外植体成活率。（6）培养条件不当：例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。（7）培养基成分：pH值与浓度过高的无机盐会使褐化程度增加，激素的种类或浓度也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐化现象加深。如6－BA或KT能促进褐变发生，而生长素类如IAA可减轻褐变发生。（8）材料转瓶周期：对于易褐变的材料，接种后转瓶时间长，伤口周围积累醌类物质增多，褐变加重，以致全部死亡。而缩短转瓶周期可减轻褐变。三、防治措施（1）选择合适的外植体及正确的处理：一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体。春季取外植体，褐变发生较轻。夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70％酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织