第三章 DNA复制课件

3DNA复制第三章DNA复制23.1DNA复制的基本原则3.2DNA复制的方式3.3DNA复制的酶类体系3.4DNA复制过程3.5端粒和端粒酶第三章DNA复制23.1DNA复制的基本原则3.1.1DNA的半保留复制

概念：在复制时，以DNA每条链为模板，合成互补链，形成的两个子代DNA分子与亲代DNA分子完全相同，各有一条链来自亲本，一条链为新合成的。

DNA复制模式的提出：半保留复制模式、全保留复制模式和分散复制模式第三章DNA复制2第三章DNA复制21958年，Meselson及Stahl以大肠杆菌为实验材料，借助放射性同位素（15N）标记和CsCl密度梯度离心（Densitygradientcentrifugation）等技术首次证明了DNA的半保留复制模型的正确性第三章DNA复制2第三章DNA复制23.1.2DNA复制的半不连续性

1968年，日本学者冈崎等用3H-脱氧胸苷标记的噬菌体T4感染大肠杆菌，再通过CsCl密度梯度离心分离出标记的DNA产物，发现先合成的是1000个核苷酸长度的片段。说明DNA复制中先合成较短片段，再由连接酶连成大分子DNA

第三章DNA复制2DNA复制是以半不连续方式进行，一条链的合成按5′→3′方向连续合成，其合成方向与复制叉的移动方向一致，称为前导链（Leadingstrand），另一条链的DNA合成是在复制叉打开到一定程度后才开始的，先合成许多不连续的小片段（冈崎片段，Okazakifragment），最后合成一条完整的DNA链，称为后滞链（Laggingstrand）。第三章DNA复制2第三章DNA复制23.1.3DNA复制的引物DNA的合成需要引物，RNA的合成不需要引物。实验证据来自M13噬菌体DNA在大肠杆菌细胞中的复制过程被利福平（Rifampicin）抑制的实验。

第三章DNA复制2第三章DNA复制2目的：保持DNA复制的高度忠实性。原因：DNA聚合酶具有校正活性，而RNA聚合酶没有校正功能。在低保真引物完成功能后将其删除，而代之以DNA聚合酶Ⅰ指导合成的高保真DNA链。结果：使DNA复制的准确性提高了105倍。

第三章DNA复制23.1.4DNA的双向复制大多数真核和原核生物的DNA都进行双向复制，即复制时两个复制叉从复制起点开始，同时向两个方向推进。当然也存在单向复制，即仅有一个复制叉运动，而另一个复制叉一直停留在复制的起点。Gyurasits和Wake通过对枯草杆菌DNA复制的放射自显影实验揭示了DNA的双向复制机制

第三章DNA复制2第三章DNA复制23.2DNA复制的方式DNA中发生一次复制的单位称为复制子（Replicon）。原核基因组中只含有一个环状的复制子，在唯一起始点启动会引发整个基因组的复制。大肠杆菌基因组从唯一的起始点OriC开始进行双向复制，形成的两个复制叉基本以相同速度推进，其复制终点在OriC正对面近乎180º处。真核细胞中的每条染色体的复制均是通过多个复制子完成的，通常也是进行双向复制，相邻复制叉相遇后发生融合，因此不存在明显的终止位点。第三章DNA复制23.2.1θ型复制原核生物DNA从起始点开始复制，随着复制叉向前推进，复制区域就像在非复制区域内产生气泡并不断扩大，形成θ结构。

Cairns揭示了大肠杆菌DNA的θ型复制过程。第三章DNA复制2第三章DNA复制23.2.2滚环复制有些环状DNA以滚环模式复制，即双链中的一条链产生一个缺口，DNA聚合酶从缺口上的3′端开始，以另一条完整链为模板进行链的延伸，这样新合成的链将替代原来的亲本链，好象模板环在不断滚动。（图3-7A

）

第三章DNA复制2图3-7B：噬菌体ΦΧ174的单链DNA首先形成双链的复制型（Replicativeform），在DNA正链的复制起始点上进行单链切断，5′端与A蛋白相连，DNA聚合酶Ⅲ以未切断的负链为模板，从正链的3′端开始不断延伸进行复制，5′端却不断地脱离环状模板被剥离出来，成为越来越长的游离单链。当复制回到起始点时，具有内切酶活性的A蛋白切割起始点并结合于新的5′端，被替代的正链以环状形式释放。

第三章DNA复制2第三章DNA复制23.2.3D环复制线粒体和叶绿体的双链环状DNA从特殊位点开始解链，但两条亲代链中只有一条作为模板（H链）合成新链，开始复制出一小段DNA，取代了原来的互补链（L链），这样一条单链和一条双链组成的结构，称为置换环（Displacementloop）或D环。随着复制的继续进行，D环不断扩大，L链被不断置换，直至L链上的起始位点暴露，开始新的H链的合成。因此双链DNA的两条链分别有自己不同的Ori。第三章DNA复制2第三章DNA复制23.3DNA复制的酶类体系3.3.1原核生物DNA复制的酶及蛋白质3.3.1.1DNA聚合酶（DNApolymerases）

大肠杆菌中至少具有5种DNA聚合酶，其中DNA聚合酶Ⅲ是复制过程中最重要的酶，DNA聚合酶Ⅰ在复制、重组以及其他修复过程中起清除作用。而DNA聚合酶Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ则均与DNA的损伤修复有关。第三章DNA复制2表3-1大肠杆菌DNA聚合酶的比较第三章DNA复制2DNA聚合酶Ⅰ主要作用是在DNA复制的过程中负责清除RNA引物，该功能依赖于其5′→3′外切酶活性。DNA聚合酶Ⅰ的“缺口平移”过程可用于制备放射性标记核酸探针。DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段称为Klenow片段，失去了原来的5′→3′外切酶活性。第三章DNA复制2第三章DNA复制2DNA聚合酶Ⅲ至少包含10个亚基。α、ε、θ三个亚基构成的催化核心，α亚基具有5′→3′聚合酶活性，ε亚基具有3′→5′外切酶活性，θ亚基负责激活外切酶活性。两个β亚基形成“夹钳”（Clamp），套在DNA模板上，在复制时沿着模板滑动，防止聚合酶从DNA上脱离。二聚化亚基τ使两个催化核心连接在一起。由γ2δδ′χψ组成的γ复合体作为夹钳装载机（Clamploader），负责将β亚基结合到DNA上。因此，DNA聚合酶Ⅲ是一个不对称的二聚体，每个单体都具有一个催化核心、一个二聚化亚基、一个具有前进能力的亚基，能同时催化两条DNA链的合成第三章DNA复制2第三章DNA复制23.3.1.2解旋酶（Helicase）

解旋酶能利用水解ATP产生的能量使DNA解链。在大肠杆菌中，有12种不同的解旋酶。解旋酶通常是多聚体，典型的是六聚体结构。第三章DNA复制2第三章DNA复制23.3.1.3单链结合蛋白

（Single-strandbindingprotein,SSB）单链结合蛋白结合并保护DNA单链，阻止其恢复成双链体状态。SSB一般以单体形式结合，但结合具有协同性。大肠杆菌的SSB是一个四聚体。第三章DNA复制23.3.1.4DNA连接酶（DNAligase）大肠杆菌的DNA连接酶分子量为74000，能催化双链DNA中单链切口处的5′-磷酸和3′-羟基形成磷酸二酯键。连接反应需要能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶是以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体则是以ATP作为能量来源。第三章DNA复制23.3.1.4拓扑异构酶（Topoisomerase）

DNA的复制和转录过程，受超螺旋结构所限制。拓扑异构酶能够调控DNA分子超螺旋水平，通过断裂和再连接DNA链，改变DNA连接数。类型：Ⅰ型拓扑异构酶断裂一条DNA链，连接数每次改变1，反应无需供给能量；Ⅱ型拓扑异构酶则断裂两条DNA链，连接数每次改变2，反应需要由ATP提供能量。第三章DNA复制23.3.2真核生物DNA复制的酶及蛋白质真核细胞拥有多种DNA聚合酶，在复制和修复过程中起主要作用的有DNA聚合酶α、β、γ、δ、ε。复制作用的酶一般是多亚基的，而负责修复的酶则通常只有一个亚基。其中DNA聚合酶γ复制线粒体DNA，DNA聚合酶β则是一种高保真的碱基切除修复酶

。第三章DNA复制2

细胞核DNA的复制主要涉及DNA聚合酶α、δ和ε。

DNA聚合酶α具有引物酶的活性和聚合酶活性，但不具备校正活性，因此现在认为DNA聚合酶α起始前导链和后滞链的合成，之后由DNA聚合酶δ继续链的延伸工作。DNA聚合酶δ不仅是具有校正活性的高保真聚合酶，而且具有高度的前进能力。

DNA聚合酶ε有时能取代DNA聚合酶δ延伸后滞链，同时也发现DNA聚合酶ε具有别的活性，比如它也能去除冈崎片段上的引物。第三章DNA复制2表3-2真核生物主要DNA聚合酶的结构及功能

第三章DNA复制23.4DNA复制过程3.4.1原核生物DNA复制的过程3.4.1.1起始大肠杆菌的复制起点为oriC，由245bp组成，关键序列：3个13bp重复序列（碱基组成：GATCTNTTNTTTT）和4个9bp重复序列（碱基组成：TTATNCANA）。

第三章DNA复制2第三章DNA复制24个9bp重复序列为DnaA蛋白提供起始结合位点，大约2~4个DnaA蛋白各带1个ATP结合在此位点上，并聚集在一起形成核心，DNA缠绕其上。HU蛋白与DNA结合，促使双链DNA弯曲，使DnaA蛋白作用于邻近3个成串排列的、富含AT的13bp序列。在ATP存在的条件下，3个13bp序列被变性，成为首先解链的位点。紧接着，2个DnaB-DnaC复合体进一步结合到解链区上并取代DnaA对13bp序列的结合，复合体分别结合于解链区的两端，各自包含1个DnaB六聚体和6个DnaC单体。DnaB利用其解旋酶活性继续扩大解链区，每个DnaB进一步激活一个DnaG引发酶，在两个复制叉上分别开始进行前导链和后滞链上RNA引物的合成，并开始DNA的复制第三章DNA复制2第三章DNA复制2在细菌的oriC中，共有11个GATC序列，Dam甲基化酶能使其中的腺嘌呤N6被甲基化。当DNA完成复制后，oriC是半甲基化状态。半甲基化的起点不能发生复制的起始，直到新链的oriC被完全甲基化。起点处的GATC的半甲基化持续时间（13min）大大超过基因组其余部位的GATC的半甲基化持续时间（1.5min）。只有与oriC靠近的dnaA基因启动子的再甲基化需要相同的延迟期。当dnaA启动子处于半甲基化时，转录被阻遏，DnaA蛋白浓度降低。即当关键性起始蛋白DnaA的合成受到阻遏时，起点也是无活性。第三章DNA复制23.4.1.2延伸延伸阶段同时进行前导链和后滞链的合成，前者持续合成，后者分段合成前导链开始合成后就一直继续下去，保持与复制叉处DNA的解旋同步。后滞链的合成则是分段进行的，需要不断合成冈崎片段的RNA引物，然后由DNA聚合酶Ⅲ延长。由于DNA的两条互补链方向相反，又由同一个聚合酶的不对称二聚体所催化，即二者的合成应该是协调一致的。因此，后滞链必须绕成一个突环（Loop）第三章DNA复制2第三章DNA复制2DnaB具有激活引物酶DnaG的功能，二者组合形成引发体（Primosome）。引发体由ATP提供能量沿复制叉方向运动，DNA聚合酶Ⅲ的一个催化核心连续合成前导链，同时另一个催化核心在后滞链突环上从一个冈崎片段滑动到另一个冈崎片段，无需从聚合酶复合体上解离下来。其基本过程如下：在DnaB解旋时，与之结合的DnaG合成一小段冈崎片段的引物，合成的方向与复制叉移动方向相反。一个新的β夹钳在此处被装配，使DNA聚合酶Ⅲ的一个催化核心被定位在该引物上。接着，DNA聚合酶Ⅲ在引物3′-OH端延伸片段，直到遇到上一个冈崎片段的引物为止，可能正是此停顿成为合成下一个冈崎片段RNA引物的信号，开始又一个冈崎片段的起始合成。随即β夹钳解离，释放催化核心和DNA链。催化核心再与下一个起始位置上的β夹钳连接，开始下一个冈崎片段的合成第三章DNA复制2第三章DNA复制23.4.1.3终止细菌环状染色体的两个复制叉一般以近似相同的速度一起向前推移，最后在oriC的对面相遇，此为复制的终止区域（Terminusregion）。大肠杆菌有5个终止位点，分别以terA~terE表示，每个ter的终止作用都是不对称的，即不让对侧的复制叉超过中点后继续复制。第三章DNA复制2ter位点上的23bp保守序列是Tus（Terminusutilizationsubstance，终止利用物质）蛋白的结合位点。Tus-ter复合体能阻碍DnaB的解旋酶活性，使复制叉的移动停止，有效避免复制过量情况的发生。两个复制叉汇合之后，复制停止。此时两环状染色体相互缠绕，成为连锁体（Catenane）。连锁体的分离需要拓扑异构酶Ⅳ参与作用，从而使两个连锁体的闭环双链DNA彼此解开，在细胞分裂时分别进入子细胞第三章DNA复制2第三章DNA复制23.4.2真核生物DNA复制的要点3.4.2.1起始真核染色体具有多个复制子，每个复制子都拥有一个复制起始位点酿酒酵母的自主复制序列（Autonomouslyreplicationsequence，ARS）可能相当于复制的真正起点。

ARS以不同的概率被使用

不同ARS元件均具有11bp的保守序列，富含AT碱基对，其临近序列也富含AT，但不具有保守性。

第三章DNA复制2所有真核生物DNA复制的起始都需要蛋白质ORC（Originrecognitioncomplex），ORC相对分子质量约400×103，由6种蛋白质组成。在整个复制过程中，ORC与ARS的11bp共同序列及临近序列结合，说明复制的启动可能依赖其条件变化，而不是重新与起始点的结合。执照因子（Licensingfactor）MCM2~MCM7的存在则是复制起始所必须的。在复制前与染色体物质结合，但在复制后可能被快速降解，只有在下次细胞分裂后才能重新进入细胞核第三章DNA复制2第三章DNA复制2真核生物DNA复制的模型：解旋酶在某一特定复制原点上使双螺旋解螺旋，具有启动功能的DNA聚合酶α在2个复制叉上合成约10个核苷酸的RNA引物和随后约20~30个核苷酸的DNA，之后，α酶被其他DNA聚合酶取代而进行延伸反应，这就是所谓的“聚合酶开关”（Polymeraseswitch）。在DNA复制延伸的过程中，三种聚合酶分别行使功能，前导链由具有高度前进性能力的DNA聚合酶δ继续复制，此时DNA聚合酶α继续在后滞链上合成引物和一小段DNA冈崎片段，然后这段冈崎片段由第三种DNA聚合酶（δ或ε）完成合成。各种辅助蛋白组分如PCNA