【猪源大肠杆菌的血清型鉴定及耐药性监测探究9800字（论文）】

猪源大肠杆菌的血清型鉴定及耐药性监测研究众所周知，我国长期以来一直是世界上出名的猪肉生产和消费国家，因此我国的肉猪养殖市场不断地发生增长。从以前的散养户到当前的大规模集中化养殖。然而由于集中规模养猪的发展，养殖的时候或多或少会出现养猪疾病，这样猪就无法得到健康的成长，在所有的疾病当中，猪源大肠杆菌疾病是养猪场内最为常见的，其病情表现得多样化和复杂。使得生产性能下落，经济效益无法增长，然而养猪成本不断攀升，使得很多养猪专业户遭受大量的损失。并且为预防和治疗细菌性疾病，抗生素被广泛应用，一些抗生素还被用作动物养殖中的促生长发育饲料添加剂，不正当的使用导致动物体内菌株对抗菌药物的抗性快速上升。一方面大肠杆菌血清型种类众多，难以确定抗原的血清型，造成疫苗免疫的针对性差和有效保护不足;另一方面多重耐药菌株的产生又使药物疗效大打折扣导致临床不能有效防治。为了解本地区猪场大肠杆菌血清型及菌株耐药情况，本研究对周边20个中小规模养猪场和屠宰场进行病料采集和大肠杆菌分离鉴定，并进行药敏试验和血清型鉴定，为本地猪场大肠杆菌病防治提供理论依据。关键词：猪源大肠杆菌；血清型鉴定；耐药菌株目录TOC\o"1-4"\h\u87391前言 184911.1研究背景 1177691.2研究目的意义和主要内容 1236452猪源大肠杆菌概述 154802.1猪源大肠杆菌概述 155702.2猪源大肠杆菌病的流行病学 2252722.3大肠杆菌抗原特性 2246982.4抗生素防治研究进展 233833猪源大肠杆菌血清型鉴定 3228233.1目的与意义 3292683.2材料 355063.2.1猪血清样品及病料 3283573.2.2培养基 3117223.2.3材料设备 458233.3鉴定方法与结果 557673.3.1细菌培养 584933.3.2鉴定方法 5300603.3.3血清鉴定结果 696053.4讨论 6129084猪源大肠杆菌耐药性检测 623244.1研究的目的与意义 6200184.2材料 782014.3鉴定方法与结果 745104.3.1药敏试验 7265044.3.2致病菌大肠杆菌分离鉴定结果 715294.3.3耐药性测定结果 7106274.4讨论 8255995猪源大肠杆菌灭活疫苗的制备及免疫保护效力评价 882385.1目的与意义 8225065.2试验方法及材料 877545.2.1材料 8110435.2.2方法 8109095.3结果分析 9103185.3.1灭活苗的研制 9123675.3.2灭活苗的检验 9298875.3.3免疫保护试验 9130615.4讨论 9129636结论 911498参考文献 111前言1.1研究背景随着生猪产业的发展，猪源大肠杆菌疾病风险也不断加大，猪源大肠杆菌疾病传播不断加快，猪源大肠杆菌疾病致死率不断上升。猪源大肠杆菌疾病已成为威胁生猪产业健康发展、食品质量安全、公共卫生乃至国家经济社会发展的重大问题。猪源大肠杆菌疾病主要有仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病，仔猪黄痢、仔猪白痢是危害现在猪养殖业重要传染病之一，它具有较高的发病率和死亡率，主要危害1-7d的仔猪，但是感染肠致病性大肠杆菌(Escherichiacoli)是仔猪黄痢、仔猪白痢的主要原因。仔猪黄白痢又称早发性大肠杆菌病，由致病性大肠杆菌引起，一种主要发生于1-7d仔猪急性、致死性传染病，该病有高的发病率(90%-95%)和死亡率（30%），尤其是首胎母猪，发病率可达85%以上，其临床表现为腹泻、排除黄色水样粪便和迅速死亡[1]。环境因素、母猪体质和营养水平常常影响仔猪肠道微生物稳态是诱发仔猪黄痢的重要原因，带菌母猪和患病仔猪是仔猪黄痢主要传染源，通常通过污染母猪皮肤、乳头和环境，因此初生仔猪吸吮乳头、接触母猪皮肤及被感染的食物饮水时，病原就可以通过仔猪消化道从而导致仔猪黄痢的发生，因此，该疾病显著影响仔猪存活率和断奶重，严重制约生猪养殖业的健康发展。猪源大肠杆菌疾病俨然已成为制约生猪产业发展的关键因素，极大的影响着生猪安全生产以及人类健康，因此做好猪源大肠杆菌疾病的防控成为世界各国发展生猪产业，稳定生猪市场与社会经济秩序的重要课题。鉴于此原因，本课题于本地区的养猪场的仔猪进行取样，取样前对仔猪的体况进行检查，采样后封存于无菌试管中，随即送到实验室进行猪源大肠杆菌疾病病原分离鉴定，明确猪源大肠杆菌疾病的发病情况，为猪源大肠杆菌疾病的治疗和预防提供有用的理论依据。1.2研究目的意义和主要内容基于致病性大肠杆菌是导致仔猪黄痢、仔猪白痢的重要原因，本文主要对猪源大肠杆菌的血清型鉴定及耐药性监测进行研究，旨在了解猪源大肠杆菌疾病的感染状况，确定本地区的猪源大肠杆菌疾病主要病原及其分布特点，为制定科学合理的防治对策提供科学依据；同时针对目前猪源大肠杆菌疾病发生和流行特点，制定出系统的保健计划，确保养猪业健康、持续、快速地发展。为了避免仔猪黄白痢的进一步蔓延，及时采取有效的防控措施，确保仔猪不受病害的危害，使仔猪健康生长，避免猪场的严重经济损失，为地区防治该病提供理论依据和技术指导。2猪源大肠杆菌概述2.1猪源大肠杆菌概述大肠埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)俗称大肠杆菌，属于埃希菌属，菌体周生菌毛和鞭毛，部分菌株有微夹膜，大多数菌株有运动性。菌株经革兰染色后以油镜观察，视野中可见粉红色短杆菌，大小约为0.4μm~0.7μm×2μm~3μm，是兼性厌氧菌，能在多种培养基中生长，菌落在普通营养琼脂平板上生长为灰白色，在伊红美兰琼脂平板上生在为蓝紫色且具有金属光泽，在麦康凯琼脂平板上生长为粉红色，可通过菌落在不同培养基上形态进行鉴别和纯化。非致病大肠杆菌是肠道正常菌群的组成部分，而致病性大肠杆菌可引起动物发生腹泻、败血症和衰竭等症状，严重时甚至会导致动物死亡[2]。2.2猪源大肠杆菌病的流行病学猪大肠杆菌一般为仔猪黄白痢，仔猪黄白痢的致病原因是由大肠杆菌而引起的一种多发性传染病。仔猪黄白痢，又称仔猪大肠杆菌病，这种传染病致死率比较高，发病表现为腹泻、排黄白色或黄色水样排泄物和快速脱水。1周或者1-3天的仔猪是最常见的。仔猪在同一窝中的发病率很高，通常在90%以上，死亡率很高，有时甚至整窝都出现死亡的情况。仔猪白色痢疾又称延迟性大肠杆菌病。临床表现为腹泻、排白乳、黄白色或灰白色痰粘液便。仔猪黄白痢是世界范围内的一种普通病和多发病，其特点是发病范围广，发病率较高，耐药性强和治愈率低[3],大肠杆菌则是引起仔猪黄白痢最重要的病因之一,随着现代化养殖业的不断发展，虽然各种医疗条件和养殖业的养殖环境都在不断提升，但是国内各个地区的仔猪黄白痢的发病率依然没有明显下降，随之而来的是高质量猪肉的减少,如何降低仔猪黄白痢的发病率对生猪养殖业造成的巨大的危害，如何降低仔猪黄白痢的发病率是当前亟待解决的一个关键环节[4]。近年来，该病严重危害了我国养猪业。2004年7月至2005年7月，石爱华对辽宁省锦州市34个乡镇65名农民80头母猪生产的809头仔猪进行了调查[5]。结果表明，该病发生在全镇调查。平均发病率和死亡率分别为20.3%和27.5%，给当地养猪业造成了巨大的经济损失。申胤生等人报道，2006年2月至4月，陕西省某大型养猪场16窝仔猪在出生后2-3天死于大量疾病。最后的诊断是由小猪体内的大肠杆菌引起的[6]。据文献记载，该病主要导致1～30日龄仔猪感染黄、白粪便并迅速死亡。发病率为90%-95%。头发病的发病率在30-60%之间。死亡率一般在30%左右，其中一些超过80%[7]。它是影响大型养猪场和农村散养仔猪成活率的一种重要疾病。因此，对该病的研究对整个养猪业的健康发展，提高农民的经济水平，促进整个国民经济的健康有序发展具有重要意义。2.3大肠杆菌抗原特性大肠杆菌抗原主要有菌体抗原(O),鞭毛抗原(H)及勃附素抗原和荚膜抗原(K)，大肠杆菌一共有抗原有173种，K抗原有80种，H抗原有56种，不同动物对大肠杆菌的血清型敏感性不同，猪主要对O8、09、0139等13中血清型敏感，并且由于不同地区或者不同养殖场的管理不同，导致在不同地区或者不同养殖场流行的O抗原的血清型有所不同，大肠杆菌的K抗原属于勃附素，与仔猪腹泻密切相关的K抗原包括F4、F5、F6、F41四种，而大肠杆菌的H抗原与仔猪腹泻关系较小。2.4抗生素防治研究进展抗生素疗法是目前针对致病性大肠杆菌的常规疗法，常与补液疗法联合使用。目前，我国在临床上普遍使用的抗生素包括β内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类。抗菌药物的不断应用导致大肠杆菌耐药菌株不断增加，致使治疗效果愈发不理想。临床上经常使用的广谱高效抗生素类药物在抑杀病菌的同时，也会对动物胃肠中正常有益微生物菌群造成损害，致使动物机能紊乱。所以在使用抗生素治疗大肠杆菌时，首先应进行药敏试验，根据药敏实验结果选用针对性较强的抗生素，并根据患病动物反应及时调整用药方案。随着抗生素的使用，细菌耐药性越来越高。杨莉，余波等为了解贵州省猪源大肠杆菌对抗生素耐药的情况，采集2018—2019年贵州省5个市县规模猪场的粪便和样品1202份,经分离培养和生化鉴定,获得大肠杆菌532株,药敏试验结果显示大部分大肠杆菌分离株对抗生素多重耐药,这对指导贵州大肠杆菌病防治具有重要的临床意义。每个地区饲养模式、疾病防控、管理水平等差异导致大肠杆菌的耐药存在明显的地域差性和耐药情况越来越严重，因此有必要进行寻找新型的防治药物和技术手段。3猪源大肠杆菌血清型鉴定3.1目的与意义猪大肠杆菌疾病是养猪场最为常见和造成经济损失比较严重的一种肠道疾病，猪大肠杆菌疾病一般为仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病，造成严重的经济损失。国内外对猪大肠杆菌疾病作了大量研究，但是猪大肠杆菌疾病的发生受到仔猪生活环境、自身的免疫力和饲养管理条件的影响，在不同的区域发病率有所不同，猪大肠杆菌疾病的发生大多数是由病原微生物引起的。为了掌握本地区猪场大肠杆菌血清型分布和耐药情况，2020年5月至2021年1月，对本地区20个中小规模养猪场和屠宰场进行病料采集和大肠杆菌分离鉴定，并进行血清型鉴定，为本地猪场大肠杆菌病防治提供理论支持。3.2材料3.2.1猪血清样品及病料采自本地区20个中小规模养猪场，共计200份，均为仔猪。这20个规模化猪场（编号：A1-A20）饲养规模在300头母猪群到800头母猪群之间，均为一条龙式生产，饲养品种为杜洛克-长白-大白；PRRS，PCVII，MH以及APP均没有免疫；PR的免疫程序为种猪3-4次年，生长育肥猪在65-70日龄免疫一次，使用的疫苗为进口gF一缺失弱毒活疫苗；CSF免疫程序为种猪2次/年，仔猪在25和65日龄免疫2次，使用兔化弱毒细胞苗。3.2.2培养基表3-1培养基、试剂、仪器及生产厂家培养基及试剂名称生产厂家普通肉汤培养基广东环凯微生物科技有限公司科技有限公司琼脂肉汤培养基上海生工生物工程技术服务有限公司鲜血琼脂平板购自宝生物工程(大连)有限公司河南比根生物科技有限公司4SGreen核酸染料上海生工生物工程技术服务有限公司胰蛋白胨大豆琼脂青岛海博生物技术有限公司葡萄糖杭州天和微生物试剂有限公司甘露醇杭州天和微生物试剂有限公司微量生化发酵管杭州天和微生物试剂有限公司麦康凯琼脂培养基上海市医学化验科技有限公司西蒙氏枸橼酸盐琼脂北京奥博星生物技术有限公司伊红美蓝琼脂培养基（EMB）北京奥博星生物技术有限公司马铃薯葡萄糖琼脂青岛高科园海博生物技术有限公司厌氧菌琼脂青岛高科园海博生物技术有限公司三糖铁琼脂培养基（TSI）北京奥博星生物技术有限公司甘露醇发酵青岛高科园海博生物有限公司5%绵羊血琼脂平板青岛高科园海博生物有限公司血液琼脂基础培养基青岛高科园海博生物技术有限公司磷酸盐缓冲稀释液青岛高科园海博生物技术有限公司抗生素药敏片上海士锋生物科技有限公司MH肉汤青岛高科园海博生物技术有限公司革兰氏阳性菌鉴定板河南牧业经济学院实验中心提供革兰氏阴性菌鉴定板（GNID）河南牧业经济学院实验中心提供普通肉汤培养基制作：称取牛肉膏3～5g、蛋白胨10g、NaCl5g、K2HPO41g、蒸馏水1000ml，将上述物质混合摇匀后加热溶解，以0.1mol/LNaOH溶液调整酸碱度至pH7.4～7.6，用滤纸过滤后分装，置高压锅内121℃灭菌15～30min备用。7.5%NaCl营养肉汤培养基制作：在普通肉汤培养基制作的基础上，将肉汤中NaCl含量增加，配制为7.5%NaCl营养培养基。普通琼脂培养基制作：将琼脂按500ml肉汤内加10g的比例加热煮沸，琼脂完全溶化后调pH至7.4～7.6，再加热20min，用纱布夹脱脂棉过滤、高压灭菌制成斜面或平皿待用。5%鲜血琼脂培养基：将灭菌后的普通琼脂培养基加热融化，降温至50℃左右，加入5%无菌脱纤绵羊或家兔鲜血，混合均匀后，分装入灭菌试管或平皿。待凝固后，置37℃培养24h，检验无菌后即可使用。3.2.3材料设备试验过程中所用试验仪器和试剂耗材见表3-2所示。表3-2试验仪器和试剂耗材仪器名称Apparatus型号Model购买厂家或地址CompanyorAddtess无菌操作台HD-850上海胜卫电子科技有限公司台式高速离心机H2-16KR上海卢湘仪离心机仪器有限公司Eppendorf移液器系列1000µL,200µL,100µL,20µL10µL,2.5µL德国台式温床振荡器IS-RSD3苏净集团苏州安泰空气技术有限公司PCR仪SelectCyclerII上海巴玖电子天平FA系列上海丙林电子科技有限公司凝胶成像仪KodakDC120美国超低温冰箱DW-86L338海尔三恒电泳仪EPC3000上海超净工作台CJ-2D天津泰斯特电热恒温水浴锅21-6江苏常熟冰箱BCD-257SL美的紫外分光光度计CintraGBC公司全温振荡培养箱TS-2102GZ常州高德仪器制造有限公智能水浴恒温振荡器ZYS-300A黑龙江东拓仪器制造有限公司超低温冷冻储存器DW-HL3958中科美菱低温科技股份有限公司奥林巴斯显微镜CKX53日本立式压力蒸气灭菌器LDZH-200KBS上海申安分析天平BA600－4麦克奥迪实业有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG－9033B5上海新苗医疗器械电热恒温培养箱LDZM中科美菱低温科技股份有限公司3.3鉴定方法与结果3.3.1细菌培养在病原菌分离培养前，先将样本充分混合均匀，严格无菌操作，将样本分别接种于普通琼脂斜面、普通肉汤和5%鲜血琼脂斜面，置37℃恒温箱进行培养增殖24h，观察培养物生长情况和菌落形态特征，并进行记录。对菌落进行涂片，革兰氏染色后镜检，根据培养物镜检结果，选择特征性菌落接种血琼脂和普通琼脂、普通肉汤培养基、麦康凯琼脂平板培养基，置恒温箱72h重新培养，用于细菌鉴定和PCR分子鉴定。3.3.2鉴定方法3.3.2.1病原菌培养和镜检鉴定培养到一定时间后，观察培养基上有没有菌落生长，如果有，再进行观察细菌生长的菌落形态、大小、规则度、颜色等。链球菌在普通琼脂培养基上生长不良或不生长，在5%鲜血琼脂上生长为细小光滑、扁平或突起、边缘整齐白色菌落，进行记录。肉汤接种培养后，观察肉汤透明度、浑浊程度、是否管底有沉淀物、沉淀物特征、管壁是否有附着物，是否出现菌腊膜、菌环等。在肉汤中除乳房链球菌使肉汤一致混浊外，无乳、停乳链球菌在管底形成絮状沉淀。肠杆菌在肉汤中呈均匀混浊，管底有粘性沉淀，液面管壁有菌环。然后进行记录。除此之外，对于培养的细菌进行涂片染色镜检，初步来鉴别细菌类别，显微镜下来观察细菌形态特征，根据病原菌大小、形态、有无荚膜、芽孢等特征进行细菌初步鉴定。3.3.2.2病原菌的生化鉴定把纯化培养基的病原菌分别进行IMViC试验，包括吲哚、甲基红(MR)、VP及枸橼酸盐利用等试验，进一步进行三糖铁斜面培养，观察试验结果并拍照记录，目的是用于确定纯化培养基中的细菌是否为大肠杆菌，观察并记录结果。表3-3大肠杆菌和克雷伯氏菌培养基生长特征名称生长特征血液琼脂基础培养基麦康凯琼脂培养基大肠杆菌菌落生长较好，灰黄色，表面光滑湿润，有时出现β-溶血现象。生长较好，粉红色不透明，放置后菌落颜色开始由红变白。克雷伯氏菌菌落生长旺盛，色黄，表面呈隆起，光滑湿润。生长特别旺盛，2-3mm，高度隆起，粉红色不透明，放置后菌落转白。表3-4大肠杆菌的生化鉴定指标菌名三糖铁脲酶枸橼酸盐MR葡萄糖甘露醇吲哚VP乳糖阿拉伯糖大肠杆菌克雷伯氏菌–––––+++±+++–±±–++++将鉴定后的菌株接种于营养琼脂斜面培养基37℃过夜培养，用0.5%石碳酸生理盐水2mL冲洗细菌菌落，收集密封在5mL玻璃瓶内并用生理盐水稀释至1×1010CFU/mL，121℃高压灭菌2h，作为待检抗原备用。移液枪吸取O抗原单因子血清1滴到玻片上，再取1滴待检抗原加入血清，立即混匀，静置5min后观察结果，如果出现凝集则为阳性。以待测抗原和生理盐水混合液作为空白对照，排除细菌自凝现象。3.3.3血清鉴定结果所有420份血清样本检测总结果显示，PRV的阳性率为6.2%（26/420）。各猪场及各生长阶段猪群检测结果如下：43株分离菌中的35株分属6种血清型，优势血清型为O149、O20、O141、O8、O137、O87,血清型的菌株占已鉴定菌株的94%。另有6株未能定型，占分离菌株的18.6%,详见表3-5。表3-5样本检测血清型情况血清型O149O20O141O8O137O87菌株数864351来源猪场数6421313.4讨论对43份大肠杆菌进行血清定型实验，共有6种。而且本地区内各个猪场之间亦有所不同，同一猪场可存在多个血清型。且血清型十分复杂，这与猪场不断从外地引进种猪更新猪群，以及这些菌株的变异性和更迭性等有密切关系。而且，各猪场不同时期流行的血清型也不尽相同。因此，在防治本病时应充分注意，必须定期对猪场的大肠杆菌进行分离鉴定，选择疫苗时应与本地流行血清型相对应，选用针对性较强的菌株制苗进行免疫，有条件的猪场应进行血清型的诊断或采用本地(场)菌株制造灭活疫苗进行预防接种。4猪源大肠杆菌耐药性检测4.1研究的目的与意义大肠杆菌容易接受其他细菌的耐药基因或在抗生素压力下产生耐药性，可通过多种遗传因素将耐药基因转移到敏感菌株，从而导致细菌耐药性的传播，提高细菌耐药性会导致细菌性动物疾病不能用常用药物治愈，而被迫增加抗生素的剂量或使用更多的抗生素，进一步促进耐药性的增长，从而造成恶性循环。4.2材料病料来自于本地区4个区县共计420份样本，送往实验室进行病原微生物的分离鉴定和分子鉴定（PCR法）。试验过程中所用试验仪器和试剂耗材见表3-1、3-2所示。4.3鉴定方法与结果4.3.1药敏试验在分离培养细菌的培养皿中，加入1ml生理盐水，用无菌接种环刮取培养基表面菌落，使之尽可能多地进入生理盐水中。取硫酸钡标准比浊管，与菌液比浊，用生理盐水稀释菌液到标准浊度。用1ml灭菌吸管吸取细菌悬液，在90mm平皿培养基内加入约0.4ml，用涂菌棒涂匀。静置5min，待菌悬液稍干后，沿平皿边缘（距皿壁约1cm）均匀贴上药敏纸片。每个平皿内贴5个，将平皿倒置于37℃恒温培养箱内培养10h后取出，用卡尺测量每个药敏片的抑菌范围即抑菌圈直径，并记录。根据美国临床和实验室标准协会抗菌药物敏感试验标准M100来判断致病菌对各种抗生素的耐药程度，抑菌范围d≥20mm以上为高度敏感，15mm＜d＜19mm范围为中间；d≤14mm为耐药。4.3.2致病菌大肠杆菌分离鉴定结果致病菌大肠杆菌分离鉴定共计420份样本进行细菌分离鉴定，病料接种麦康凯平板，在71份样本中分离到48株菌落呈圆形、中等大小的砖红色疑似大肠杆菌的菌株。将48株红色菌落中的细菌分别进行生化试验，有3株产H2S(YJX3，CYQ9，FMQ6)，1株VP试验和构椽酸盐利用试验为阳性(PSS9)，1株MR试验和JIA试验为阴性，予以剔除，其它菌株均能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇产酸。各菌株均不产生HzS。根据伯杰氏细菌鉴定手册，鉴定出大肠杆菌43株。4.3.3耐药性测定结果结果表明，所分离到的大肠杆菌对硫酸链霉素、头孢噻肟、氧氟沙星、先锋灵针剂、乳酸诺氟沙星和复方新诺明比较敏感，但对壮观霉素和磺胺嘧啶钠都产生耐药性，不同的致病菌对不同的药物敏感度有所不同。表4-1致病菌耐药试验结果抗生素名称药敏片含量（μg/片）大肠杆菌阿米卡星30S硫酸链霉素10I头孢噻肟30S恩诺沙星5R氧氟沙星5S林可霉素2I庆大霉素10I壮观霉素10R硫酸卡那霉素30S磺胺嘧啶钠250R先锋灵针剂30S四环素30R盐酸环丙沙星5S乳酸诺氟沙星2I克林霉素2I盐酸土霉素30R复方新诺明100S头孢曲松30S注：S代表敏感（抑菌环在˃20mm），I代表中介（抑菌环15mm＜d＜19mm），R代表耐药（抑菌环d＜14mm）4.4讨论在药敏耐药性试验中可知，不同的地区和不同规模的养猪场分离出的细菌对抗生素产生不同程度的耐药性，有的抗生素敏感度很高，这可能是由于本试验调查的养猪场条件不同，治疗方面所用抗生素种类也有所不同，所以，分离出的致病菌中都有不同程度的耐药性，试验结果与国内有关报道基本吻合。5猪源大肠杆菌灭活疫苗的制备及免疫保护效力评价5.1目的与意义尽管抗生素对仔猪黄痢具有较好的防治效果，但是随着抗生素的滥用导致大肠杆菌具有较高的耐药性；因此针对当地优势大肠杆菌血清型自制相应的灭活苗进行产期母猪免疫可有效预防仔猪黄痢的发生，从而保证仔猪的健康生长。5.2试验方法及材料5.2.1材料试验菌株、麦康凯琼脂培养基、普通肉汤培养基、普通琼脂培养基、福尔马林、妊娠母猪杜洛克(由本地区某养猪场提)。5.2.2方法5.2.2.1灭活苗的研制将血清型菌株接种于营养琼脂平板上，在37℃生化培养箱中培养18～24h，再用无菌生理盐水轻轻冲洗。将洗涤后的培养物收集并包装在灭菌瓶中。用Macintosh比浊法测定各血清型菌株的细菌数。根据细菌数量，加入不同量的无菌正常盐水，使其含有细菌总数，然后在细菌稀释液中加入体积为0.4%的福尔马林，轻轻摇动，于37℃条件下灭活，48h后包装密封。5.2.2.2灭活苗的检验取适量的灭活苗，采用妊娠母猪安全性进行检查：选择10头产前15d左右的妊娠母猪，皮下注射4ml灭活苗，试验期为一周，观察妊娠母猪的采食、生长状态、流产情况及产后新生仔猪的生长情况等。5.2.2.3免疫保护试验灭活苗对妊娠母猪免疫保护的影响选择10头产前15d左右的妊娠母猪，皮下注射2ml的灭活苗，待妊娠母猪产子后，选择10头体重相近的仔猪，采用灭活前的混合细菌悬液(2ml)对相应的仔猪进行攻毒，试验期为一周，观察仔猪断奶期内的生长情况，并记录仔猪发生黄痢的头数和死亡情况，测定其对仔猪的保护率。5.3结果分析5.3.1灭活苗的研制将灭活苗接种于普通琼脂或麦康凯琼脂平板上后通过显微镜观察发现培养基上无任何微生物生长。5.3.2灭活苗的检验采用妊娠母猪对灭活苗的安全性进行检查发现，在注射一周后，妊娠母猪无异常反应，健康状况良好，采食正常，无流产等现象，灭活苗注射未对母猪、胎儿及新生仔猪无负面影响。5.3.3免疫保护试验采用灭活苗进行免疫后，使仔猪黄白痢的发生率降至10.98%，单因素方差分析结果表明灭活苗对仔猪黄白痢有显著的的预防效果。5.4讨论猪大肠杆菌优势血清型制备灭活疫苗，该灭活苗对母猪、胎儿及新生仔猪没有负面影响；并且能显著降低猪大肠杆菌病的发病率和死亡率，灭活苗免疫对仔猪具有显著的保护作用。6结论本文对本地区养猪场进行调查，从细菌分离鉴定试验中，我们可以得出在71份样本中分离到48株菌落呈圆形、中等大小的砖红色疑似大肠杆菌的菌株。从各猪场血清检测结果来看，所有420份血清样本检测总结果显示，PRV的阳性率为6.2%（26/420）。各猪场及各生长阶段猪群检测结果如下：43株分离菌中的35株分属6种血清型，优势血清型为O149、O20、O141、O8、O137、O87,血清型的菌株占已鉴定菌株的94%。另有6株未能定型，占分离菌株的18.6%。并且420份样本进行耐药性试验表明，不同的菌株对抗生素均有一定的耐药性。基于以上内容的分析，得出早期断奶仔猪腹泻的原因很多，也是现阶段早期断奶仔猪常见的问题。如未能加以有效的防治，则可能使仔猪走向死亡，并且给养殖户带来一定的经济损失。对于仔猪黄白痢病的防治，本文提出以下几点建议:一是合理设置生产用房，做好生产用房消毒工作，及时清理生产用房，保证生产用房的清洁卫生。建立健全猪场生物安全体系，以卫生清洁消毒为中心，将消毒卫生工作贯穿于猪场生产的各个环节。其次，加强母猪的产期管理，增强母猪的抗病能力，预防疾病的发生。断奶后仔猪免疫力增强，饲料粗蛋白水平逐渐提高。参考文献BelaN,PeterZF.2005.EnterotoxigenicEscherichiacoliinveterinarymedicine.InternationalJournalofMedicalMicrobiology,295:443~454.单玉平,朱国强,李锋,等.连云港市规模