第三章 遗传物质的复制课件

中心法则

(TheCentralDogma)转录翻译逆转录DNARNA蛋白质复制SmallRNA1第三章-遗传物质的复制第三章遗传物质的复制

2第三章-遗传物质的复制第一节核酸复制的特征

第二节参与复制的酶和蛋白质因子

第三节原核生物的复制机理

第四节病毒基因组复制的多样性

第五节真核生物的DNA复制

第六节复制的忠实性3第三章-遗传物质的复制1、按照碱基配对原则，以现有的DNA链为模板合成新拷贝；部分DNA是以RNA为模板反转录的结果；2、核酸的生物合成只能从5’3’方向进行；3、特异的聚合酶类催化核酸的生物合成；4、聚合酶的底物核苷酸是5’-NTP或5’-dNTP；5、DNA聚合酶不能催化从头开始合成DNA，必需具有引物。第一节核酸复制的特征一、核酸生物合成的一般规则4第三章-遗传物质的复制二、复制可能的几种方式图3-1三种不同的复制模型5第三章-遗传物质的复制图3-2Meselson-Stahl实验（a)实验结果的解释（b)CsCl梯度离心实验（c)离心后DNA的吸收值Meselson-Stahl密度标记实验

半保留复制的实验证实(1)6第三章-遗传物质的复制

图3-3Taylor蚕豆根尖放射自显影实验。

(a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。半保留复制的实验证实(2)7第三章-遗传物质的复制半保留复制（Semi-conservativeReplication）

DNA复制是分别以亲代螺旋双链中的一条为模板合成其互补链，由此产生的两条子代双螺旋都是由一条亲代链和一条新合成链组成，因此称做半保留复制。8第三章-遗传物质的复制

三、复制子、复制起始点与终止点1、复制子（replicon）:

1）复制子是基因组中

DNA分子的复制单位；2）复制子含有控制复制起始的特定位点，即复制起始点，以及控制复制终止的终止点。因此复制子是从复制起点到终止点的区域；3）细菌染色体、质粒、病毒只有一个复制起点，整个DNA分子构成一个复制子；真核生物染色体有多个起始点，含多个复制子。9第三章-遗传物质的复制Table1

EukaryoticrepliconsaresmallandreplicatemoreslowlythanbacterialDNA．10第三章-遗传物质的复制2、复制起点(origin)1）原核生物的复制起点特征：通常富含A/T碱基对，常见回文序列和重复序列的结构；复制起点中的顺式DNA序列（反向重复顺序）通过与特异的反式作用蛋白质因子反应激活复制；原核生物复制起点常有较固定的碱基顺序和结构，不同物种间保守性较高，某些位点的单碱基缺失即可使复制子失活。

功能：可以起始一个复制循环，并控制起始反应的频率；把完成复制的染色体分配到子细胞中去。11第三章-遗传物质的复制

E.coli的复制起点大肠杆菌复制起点oriC最小功能片段长度245bp，是含有4个9bp的反向重复和3个13bp的正向重复的特征DNA序列；这些重复序列富含A-T，有利于双链解链；OriC中含有9-14个GATC序列，复制起始前，其中的A被Dam甲基化，则起始点被活化。12第三章-遗传物质的复制13第三章-遗传物质的复制细菌复制起点的保守性14第三章-遗传物质的复制2）真核生物的复制起点酵母DNA的复制起点——自主复制序列（ARS）酵母染色体为多复制子，但不同的起点使用频率有差别；复制起点ARS1：185bps，由A、B1、B2和B3四个元件组成，这4个元件为都是ARS1功能所必需；A元件为核心元件，该改变任何一个碱基将导致ARS1失活。AnARSextendsfor~50bpandincludesaconsensussequence(A)andadditionalelements(B1-B3).

15第三章-遗传物质的复制1、复制叉（replicationfork）DNA复制过程中亲本双螺旋DNA两条单链解离的位点，由于双链解离从而呈现叉状；2、复制方向

DNA复制大多为双向等速进行，此外还有不对称的双向复制（枯草杆菌）和单向复制（mt

DNA

D-环式复制）。

3、复制速度原核生物DNA复制速度较快，如E.coliDNA复制速度大约是105bp/min;真核细胞的DNA聚合酶活性低，复制速度约为500-5000bp/min；从多复制原点同时开始并双向复制。

四、复制叉与复制方向16第三章-遗传物质的复制复制叉ReplicatedDNAisseenasareplicationeyeflankedbynonreplicatedDNA.17第三章-遗传物质的复制Repliconsmaybeunidirectionalorbidirectional,dependingonwhetheroneortworeplicationforksareformedattheorigin.复制方向18第三章-遗传物质的复制19第三章-遗传物质的复制五、复制方式的多样性1、根据形态可分为：1）线形DNA双链的复制

线性DNA双链的复制叉生长方式有单一起点的单向（如腺病毒）及双向（如T7噬菌体）和多个起始点的双向，复制叉处呈现“眼”型；2）环状DNA双链的复制型大肠杆菌DNA复制中间体就是型，环状双链DNA分子复制时形成两个方向相反的复制叉；滚环型一种单向复制方式，如X174的双链环状DNA复制型（RF）；D-环型一种单向复制的特殊形式，两条链的复制起点不重合，各有一复制起点。动物线粒体DNA的复制采用的就是D-环型复制方式。20第三章-遗传物质的复制线形DNA双链的复制21第三章-遗传物质的复制型复制DNA从一点开始，单向或双向复制，产生一个或两个复制叉，对一个线状分子而言在电镜下可见“眼状”结构。对于环状分子而言“眼”的出现是一种“

结构”。22第三章-遗传物质的复制23第三章-遗传物质的复制

X174RF的复制过程滚环式复制

24第三章-遗传物质的复制λ噬菌体DNA的滚环复制模型滚环复制：在一条链上产生一个缺口，DNA多聚酶延伸这一缺口的3’-OH端，新合成链替换原先的亲链，因为增长点看上去好象在围着环状模板链生长而得名，因而叫做滚环复制。因其形状象希腊字母

，因此又叫

复制。25第三章-遗传物质的复制D-环型复制双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的单链环（即D-环）。26第三章-遗传物质的复制2、根据DNA合成的起始方式

重新起始(denovoinitiation)，子链的复制是重新开始，如复制叉式复制；共价延伸，子链是共价结合在一条亲本链上，如滚环式复制。27第三章-遗传物质的复制六、半不连续复制SemidiscontinuousReplication1、几个概念半不连续复制

DNA以两条亲本链为模板合成子链时，一条子链的合成是连续的，另一条是不连续的。前导链与后滞链（leadingandlaggingstrand）DNA双链复制时，一条子链沿自身5‘→3’方向持续合成，即前导链；而另一条子链的合成是不连续的，即后滞链。冈崎片段(Okazakifragment)后滞链合成时，先以亲本链为模板按5’→3’方向合成出许多1kb-2kb的不连续片段，被称做冈崎片段；然后这些短片段共价联结成一条完整的后滞链，后滞链的成长方向与其片段的合成方向相反。28第三章-遗传物质的复制2、半不连续复制

Theleadingstrandissynthesizedcontinuouslywhilethelaggingstrandissynthesizeddiscontinuously.29第三章-遗传物质的复制第二节参与复制的酶和蛋白质因子

复制体（replisome）

担负DNA合成的多聚蛋白结构，在复制叉处装配。包括了DNA聚合酶和其它酶类。构成复制体的几种主要酶类及蛋白质因子DNA解旋酶（DNAhelicase）DNA拓扑异构酶（topoisomerase）单链结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA连接酶（DNAligase）DNA引发酶（DNAprimase）RNaseH30第三章-遗传物质的复制（一）DNA解旋酶（helicase)

DNA双链解旋：该酶沿单链DNA移动，利用ATP水解获得能量打断氢键。解旋酶是DNA复制过程中进入复制体的第一个组分，是复制过程中提供单链模板所必需的。E.coli的解旋酶由dnaB编码，是由DnaB蛋白组成的六聚体,

具有5’-3’活性。DnaBDnaC解链方向一、超螺旋构象变化及解链有关的酶和蛋白31第三章-遗传物质的复制DNA双链解开需要有改变DNA拓扑结构的酶；解链产生扭曲张力，去除和解离复制和重组中产生的节和环。两种功能类型：I型拓扑异构酶只剪切一条链，作用于含缺口的底物；II型拓扑异构酶同时切开两条链，可作用于共价闭环链。（二）DNA拓扑异构酶32第三章-遗传物质的复制1、DNA拓扑异构酶I（TopoisomeraseI）1）特点对超螺旋DNA双链底物，仅切开一条链；配对链通过切口及断端再连接而改变DNA拓扑态，一步反应可改变链环数1;不需要能量，不能除去正超螺旋等需能量的反应，对正超螺旋不敏感；主要在DNA损伤修复中起作用。

33第三章-遗传物质的复制E.coli的TopoI结合双链DNA，并切割一条链；断裂的DNA的5’-P端与酶的一条臂的Tyr残基-OH基共价连接，3’-OH端与酶的另一臂共价连接；一条臂跨过未被切断的单链后，将5’-P与3’-OH重新连接，使DNA双螺旋减少一圈。E.coli的TopoI（ω蛋白）的作用过程34第三章-遗传物质的复制1）特点同时切割超螺旋DNA的双链，并重新连接，一次反应能改变两个连环数；需要辅助因子ATP能量，能除去正超螺旋等需能量的反应；主要在DNA复制中起作用。2）TopoII可分为两个亚类一亚类能引入负超螺旋，如E.coli旋转酶（gyrase）另一亚类是使超螺旋DNA（无论正负）变为没有超螺旋的松弛DNA。2、DNA拓扑异构酶II（TopoisomeraseII）35第三章-遗传物质的复制TopoⅡ:对双链DNA同时切断，另一段DNA通过切口，然后断端按原位连接而改变DNA的拓扑态，一般反应可改变连环数2。36第三章-遗传物质的复制E.coli旋转酶（gyrase）结构特征由两个A亚基和两个B亚基构成的四聚体；A亚基具有切割双链DNA，进行拓扑结构改变和重新连接的功能；B亚基具有ATPase酶活性。37第三章-遗传物质的复制（三）单链结合蛋白（SSB）1、SSB是缺乏酶活性的复制辅助蛋白，是复制体其它酶有效活性所必需的。SSB对单链DNA有高亲和性，对双链没有亲和力。2、功能稳定DNA单链区域：稳定熔解起点、维持螺旋酶活性、从DNA模板上去除二级结构、抑制核酸酶活性；与复制体不同组分相互作用以促进这些组分的活性，例如与引发酶或引发体的组分相互作用促进其特定的引发活性。38第三章-遗传物质的复制39第三章-遗传物质的复制（一）DNA聚合酶

1、DNA聚合酶

以DNA为模板合成DNA新链时需要的酶，DNA聚合酶从5‘到3’把核苷酸连续加在延伸DNA的游离3‘羟基上。2、DNA聚合酶的特性

1）底物必须是dNTP；

2）以DNA为模板，链延伸功能，不能从头开始合成；

3）合成方向只能是5‘→3’。二、复制延伸和终止有关的酶和蛋白40第三章-遗传物质的复制3、DNA聚合酶的种类——大肠杆菌41第三章-遗传物质的复制大肠杆菌有多种DNA聚合酶，其中只有聚合酶III是DNA复制必需，作用是随复制叉移动延长新生链；聚合酶I主要是添补后滞链的间隙及负责损伤DNA的修复等功能；DNA聚合酶I具有5’→3’方向核酸外切酶活性，能切除引物RNA。42第三章-遗传物质的复制

DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III结构分子量（道尔顿）构成（亚基数）数量/细胞103,000140088,0004不清楚>900,00010异多聚体10-20酶活性5’-3’聚合酶活性3’-5’外切酶活性5’-3’外切酶活性

++++

++

（可切单链）突变突变位点突变表现型polA修复缺陷polB修复缺陷polC,dnaN,dna,dnaQ,dnaT复制受阻大肠杆菌的三种主要DNA聚合酶

43第三章-遗传物质的复制4、DNA聚合酶的种类——真核生物真核生物中发现5种DNA聚合酶，、、和定位于核内，而位于线粒体；

在DNA合成期水平升高，主要负责复制引发和后滞链部分序列的合成；

是DNA双链合成的主要聚合酶，在合成起始后存在聚合酶/的转换（switch）；DNA聚合酶

没有3’→5’核酸外切酶活性；而和有校正阅读活性，保证复制忠实性。44第三章-遗传物质的复制哺乳动物的DNA聚合酶

DNA聚合酶

DNA聚合酶

DNA聚合酶

DNA聚合酶

位置功能细胞核引发和起始复制细胞核链延伸线粒体线粒体复制细胞核后随链完成修复分子量(D)亚基数目300,0004170-230,0001180-300,000140,0001双脱氧甲基嘧啶蚜栖菌素无影响抑制弱强抑制无影响抑制无影响45第三章-遗传物质的复制5、DNA聚合酶的功能1）DNA合成所必需

DNA合成活性是所有DNA聚合酶的基本功能，在其催化下作为合成前体的dNTP可依照模板连接到新生链的3‘-OH端。

46第三章-遗传物质的复制DNA合成的两种基本类型：DNA复制和修复。Semi-conservativereplicationsynthesizestwonewstrandsofDNA.

RepairsynthesisreplacesadamagedstrandofDNA.

47第三章-遗传物质的复制2）多方面的核酸酶活性DNA聚合酶I是一“多能”酶，由polA编码，可水解成两部分：较大的部分（68KD）叫Klenow片段，具聚合活性和3‘→5’外切核酸酶活性；小片段（34KD）具5‘→3’外切核酸酶活性，外切活性可切除达10个核苷酸的小片段，利用这一功能可实现缺口平移（nicktranslation）。

利用DNA聚合酶I可进行体外的DNA放射性标记。

聚合酶III是一大的酶复合体，含多个亚基，每个亚基有不同酶活。亚基具有合成活性；而亚基具有3‘→5’核酸外切校正活性，保证复制的准确性。48第三章-遗传物质的复制49第三章-遗传物质的复制3’-5’外切功能5’-3’外切功能Klenow片段的晶体结构50第三章-遗传物质的复制缺口翻译（nicktranslation）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可利用双螺旋DNA链上由一个磷酸二酯键断裂产生的缺刻(nick)，将一条单链降解并从缺刻的3’-OH端合成一条新链替代降解的同源链，这一过程称缺口平移。51第三章-遗传物质的复制3）保证DNA复制的准确性校正(proofreading)

纠正蛋白质或核酸合成发生错误的机制，包括对已加入到合成链上的单位进行核查，对错配碱基依靠聚合酶3’→5’核酸外切活性来校正。例如，复制中每添加一碱基发生错配的几率约10

3，而实际错配率约10

8-10

10。DNA聚合酶在两个阶段控制碱基配对的特异性：

合成前错误控制：通过对不同碱基特性的特异性识别、核对所引入的碱基是否与模板碱基配对；

合成后校正：检查生长链末端碱基配对情况，通过外切功能除去错配碱基。52第三章-遗传物质的复制细菌DNA聚合酶的校正功能

Inthechainelongationstep,aprecursornucleotideentersthepositionattheendofthegrowingchain.Abondisformed.Theenzymemovesonebasepairfurther,readyforthenextprecursornucleotidetoenter.Ifamistakehasbeenmade,theenzymemovesbackward,excisingthelastbasethatwasadded,andcreatingasiteforareplacementprecursornucleotidetoenter.

53第三章-遗传物质的复制6、DNA聚合酶的结构DNA结合于三个结构域所组成的大沟上。“手掌”结构域：具有高度保守的模体，提供催化活性位点。“手指”结构域：将模板正确结合到活性位点。“拇指”结构域：行使前进能力。N结构域：核酸酶活性。54第三章-遗传物质的复制7、DNA聚合酶III全酶装配模型

、

、亚基组成核心酶，是催化核心;

亚基是进行性因子，以二聚体形式形成一个可以沿DNA滑动的“滑动夹”，使核心酶附着于模板;

复合物控制了酶的进行性，即亚基在DNA上的定位和解离都需要复合物，

亚基只与一个单体结合.

亚基连接核心酶形成二聚化;55第三章-遗传物质的复制（二）DNA连接酶专门催化“切刻”——即二酯键的5‘-磷酸基与3’-羟基的连接，要求各自的碱基处于配对状态。连接所需的能量来自NAD+（细菌）或ATP（真核细胞、古细菌）。连接酶在DNA复制、重组、修复中均有重要作用。

56第三章-遗传物质的复制（三）DNA引发酶在DNA合成过程中合成RNA引物。功能：

1）在起点处起始先导链的合成(1次)；

2）协助冈崎片段的反复起始。引发体(primesome)：由引发酶和解旋酶形成的功能复合物。引发酶的有效引发活性依赖于解旋酶。不同的复制子对引发要求不同，有的复制起点可被引发酶直接识别，没有引发体，如噬菌体G4；而型复制子的引发体含有多个蛋白，结构复杂。57第三章-遗传物质的复制复制体各组分的功能复制体成分在复制中的功能DNA聚合酶DNA连接酶单链结合蛋白DNA解旋酶DNA拓扑异构酶引发酶RNaseH多种形式，分别负责先导链的合成，后滞链的合成及后滞链的修复连接修复的后滞链片段稳定复制叉的单链区域使复制叉前面的DNA解链释放因解旋酶的活性而造成的扭曲链，复制后使松弛的DNA双链恢复负超螺旋；RNA引物的合成切除RNA引物58第三章-遗传物质的复制细菌和真核生物复制体性质比较复制体性质细菌真核生物复制起点延伸速度冈崎片段长度引发策略复制聚合酶拓扑学单个100kbpmin-11-2kbp引发酶产生引物，由polIII延伸不同进行性单体的异源二聚体松弛和卷曲间存在平衡，负超螺旋很多2kbpmin-1100-200bp由pol

引发并起始合成，由pol

延伸完成每条链有不同的酶，有不同的进行性浓缩在核小体中的负超螺旋59第三章-遗传物质的复制60第三章-遗传物质的复制一、DNA复制的起始与引发

（一）引发的一般原则与策略1、DNA单链状态是复制所必需的；2、DNA复制的起始需要引发。一般情况下，

DNA引发酶合成RNA引物用于DNA复制引发；3、原核生物中，引物直接由DNA聚合酶III延伸；4、真核生物中，DNA聚合酶在每个引物上加上4-5个脱氧核苷酸[起始DNA(initiatorDNA)]，DNA末端由DNA聚合酶δ延伸。5、先导链的引发有一系列不同的策略；而由DNA引发酶合成的短RNA引物是后滞链合成的通用引发方式。第三节原核生物的复制机理61第三章-遗传物质的复制先导链引发的不同机制引发机制细节举例RNA引物发夹引发内切引发入侵引发末端蛋白引发寡核苷酸引发DNA引发酶合成短新生寡聚核苷酸RNA聚合酶合成特殊转录本预先形成的tRNA引物的退火单链DNA反转末端重复序列形成发夹内切酶在双链DNA产生切口暴露3‘-OH3‘末端通过同源重组导入部分线形DNA由末端核酸结合蛋白引发体外延伸时寡核苷酸退火到模板上细胞DNA线粒体,ColE、逆转录病毒疱疹病毒滚环复制T4晚期复制腺病毒PCR,cDNA合成62第三章-遗传物质的复制引物1、参与引物合成的酶引发酶：细菌、部分噬菌体DNA聚合酶：真核生物、部分噬菌体；RNA聚合酶：M13噬菌体；2、引物的长度

X174和E.coli前导链：2-5个碱基；真核生物和冈崎片断：10个碱基；M13和G4：20-30个碱基。63第三章-遗传物质的复制引发的不同形式64第三章-遗传物质的复制（二）噬菌体DNA复制的引发1、单链噬菌体DNA复制的不同引发方式G4噬菌体不用RNA聚合酶，而由dnaG编码的蛋白负责引发，即引发酶；M13噬菌体以RNA聚合酶来合成引物；

X174复制RNA引物的合成需更多蛋白因子，这一蛋白复合物称引发体（primosomecomplex)；

X174是多位点引发，而另两种噬菌体是单一位点。2、引发酶

引发酶是一种特殊的RNA聚合酶，由dnaG编码，比一般的E.coliRNA聚合酶小，分子量为65kD。65第三章-遗传物质的复制单链噬菌体DNA复制中RNA引发的三种机制66第三章-遗传物质的复制3、噬菌体的复制起始复制原点大约是350bps，包括：4个高度保守的19bp组成的正向ori重复序列，40bp组成的富含A/T序列，28bp的回文序列；PROR发动的转录是

DNA复制必需的，一方面使复制原点解链，另一方面转录了基因O和基因P；O蛋白的结合位点是四个ori重复序列，随着O蛋白聚集体的形成，P蛋白和DnaB解旋酶以P-DnaB复合的形成加入，形成oriλ-O-P-DnaB复合物。P蛋白能抑制DnaB螺旋酶的ATP酶活性，因此P蛋白失活或者从复合物中脱落的情况下，DNA复制才能起始。67第三章-遗传物质的复制E.coli

复制起始有关的酶和蛋白质（三）大肠杆菌双链复制的起始68第三章-遗传物质的复制E.Coli复制起始大肠杆菌复制起点oriC最小序列245bp，含有4个9bp和3个13bp的特征DNA序列；9bp是DnaA结合位点，20-40个DnaA单体顺序结合oriC形成中央核心；3个13bp重复区段是AT丰富区，在DnaA蛋白作用下熔解；69第三章-遗传物质的复制形成起始复合物

DnaA与复制原点的4个9聚体DNA序列结合，不需要ATP。形成开放复合物

20-40个DnaA聚集于此，形成开放复合物，DNA在13聚体处熔解，需要ATP和控制DNA结构的HU蛋白。形成预引发体

DnaB解旋酶在DnaC的帮助下定位，DnaC从复合物中释放。形成引发体

DNA被DnaB解链，形成双向复制叉，引发酶加入，合成引物。DNA合成延伸

征集拓扑异构酶和SSB，在polIII作用下延伸开始。70第三章-遗传物质的复制电镜下复制起点结构

OriC形成的复合物。上面显示了复制前的预引发体复合物，下面显示起始复制1分钟后复制泡的复合物，两种复合物均可通过DnaB抗体作用观察到。

71第三章-遗传物质的复制（四）后滞链起始机制

复制叉前进后，在引发体后面产生单链区，单链区随之被SSB覆盖，后滞链处于适于做模板状态，引发体产生后滞链冈崎片段的RNA引物，因此引发体移动方向与复制叉一致但与冈崎片段延伸方向相反。

72第三章-遗传物质的复制二、复制延伸过程1.DNA复制延伸的5个阶段双链DNA不断解螺旋；前导链DNA的合成；后滞链不断合成新的RNA引物；合成冈崎片段；RNA引物去除，冈崎片段连接。73第三章-遗传物质的复制74第三章-遗传物质的复制2、双链复制回环模型1）不对称的复制体（replisome）DNA聚合酶III是不对称二聚体，有两个DNA合成的催化中心；在复制叉处，DNA聚合酶III和引发体以及其他复制蛋白构成复制复合体；每个复制中心含有两个亚基；亚基负责将DNA聚合酶III结合为二聚体。全酶是不对称的，只有一个

复合物。75第三章-遗传物质的复制DNA复制延伸时，前导链和后滞链的合成各利用DNA聚合酶III的一个催化中心；后滞链的模板围绕其中一个催化中心折叠成环状，使后滞链方向颠倒，但生化反应方向不变，使前导链和后滞链同时合成。2）双链复制回环76第三章-遗传物质的复制环上RNA引发酶形成引物，DNA聚合酶随后延伸，DNA聚合酶沿复制叉移动，复制片段延长，环变大，直至遇到下一个冈崎片段，释放环。模型的关键在于前导链与后滞链合成的进行性及DNA聚合酶的不对称性。77第三章-遗传物质的复制先导链与后滞链同时复制模型78第三章-遗传物质的复制三、复制的终止1.大肠杆菌的复制有固定的终点终止子(terminator)：染色体和质粒DNA中复制终止的特定序列；2个终止区域：每个区域含有若干个终止子(terE,D,A和terC,B)，每个终止区可终止一个方向复制叉运动。2.多数环状DNA复制没有固定终点，仅是两个生长点的简单碰撞。3.环状分子复制后产生连环分子(catenane)，在拓扑异构酶的催化下将连环分子分离。（一）环状DNA复制的终止79第三章-遗传物质的复制大肠杆菌复制的终止终止子带有约23bp的短一致序列（consensussequence）tus基因编码蛋白Tus可识别该序列并与之结合抑制复制叉的前进，ter-Tus阻断复制的功能有方向依赖性；ter-Tus复合物可能通过抑制解旋酶来实行复制终止。80第三章-遗传物质的复制81第三章-遗传物质的复制（二）线状DNA复制的完成

1、线形DNA复制存在的问题——5’末端“隐缩”82第三章-遗传物质的复制2、对策线状DNA环化（

噬菌体）或连成多聚体（T7噬菌体）；DNA形成特殊结构，如末端产生发夹，不产生自由末端；还可以形成十字交叉结构，如草履虫线状线粒体DNA复制；专一性蛋白与末端作用保证其引发，腺病毒、φX29噬菌体等线性病毒核酸有蛋白与5’末端碱基共价相连。可变末端，真核生物DNA末端有多拷贝的短重复单位，拷贝数可变化，可以加上或去掉。83第三章-遗传物质的复制1）T7噬菌体线性DNA末端复制末端冗余：T7噬菌体分子两端有重复的序列；后滞链最后一个冈崎片段的RNA引物水解后，在子代5’端各缺少一段核苷酸——“隐缩”现象；复制后两个子代分子单链末端互补、退火形成二聚体；内切核酸酶作用，产生供延伸的3’-OH端和5’突出末端。在聚合酶作用下形成正常的两个子代分子。84第三章-遗传物质的复制2）腺病毒DNA的复制复制起始85第三章-遗传物质的复制腺病毒DNA复制过程腺病毒两端有反向末端重复序列；腺病毒两端各有一复制原点；起始复合物：当腺病毒单链DNA结合蛋白和ATP存在时，末端蛋白TP催化末端解链；在腺病毒DNA聚合酶催化下dCTP与pTP以磷酸二酯键共价相连；C与模板3‘端的G以氢键相配对；通过链置换首先完成一条链的合成；被置换出的链形成“平底锅”结构，再以同样的方式复制其互补链。86第三章-遗传物质的复制第四节病毒基因组复制的多样性一、单链RNA病毒的复制1、类型：单链正RNA，即()RNA病毒单链负RNA，即()RNA病毒2、单链RNA病毒的复制酶

依赖于RNA的RNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶，即逆转录酶87第三章-遗传物质的复制3、单链RNA病毒的复制方式1）依赖于RNA的RNA聚合酶作用的复制88第三章-遗传物质的复制2）依赖于RNA的DNA聚合酶作用的复制1970年Temin和Migufan等发现逆转录酶，逆转录酶具有RNA指导的DNA聚合酶活性，同时具有DNA指导的DNA聚合酶活性，其引物是tRNA；作用过程：1）逆转录酶以病毒单链RNA为模板，在引物3’-OH端合成互补的DNA链，形成DNA-RNA杂交分子；2）RNaseH降解杂和分子中的RNA，剩下一条DNA链；3）在逆转录酶作用下，从DNA回折的3’-OH端延伸出互补的DNA链，而形成双链DNA，称cDNA。4）再从cDNA合成子代病毒RNA。逆转录病毒形成的双链cDNA常可整合入宿主，引发癌变，所以逆转录病毒常常有致癌作用。

逆转录（reversetranscription）89第三章-遗传物质的复制90第三章-遗传物质的复制HIV复制HIV进入细胞，以tRNA为引物，逆转录酶合成5’端PB/U5/R区域DNA；RNaseH切除DNA/RNA双链中的模板RNA；模板转换，新生成的DNA与HIV基因组3’端配对，在RT的作用下合成(

)DNA；RNaseH水解除env区外的大部分(

)RNA，剩余的env区小段RNA作为引物合成(

)DNA；5’端tRNA和部分(

)RNA移去，第二次跳跃，RT进行DNA复制，产生双链DNA；双链DNA末端形成U3-R-U5的长LTR结构。91第三章-遗传物质的复制二、双链RNA病毒的复制1、基因组特点：双链RNA病毒基因组是不连续，不同的双链RNA是分开的。呼肠弧病毒有10个片段，轮状病毒有11个片段。2、转录：双链RNA病毒的负链RNA合成mRNA，然后翻译成各种蛋白质；3、复制：以基因组负链RNA为模板合成许多正链RNA，再在RNA聚合酶的作用下合成双链RNA。92第三章-遗传物质的复制三、双链DNA病毒的复制93第三章-遗传物质的复制1、病毒类型：1）从携带信息来区分：基因组为()DNA和基因组为()DNA；2）从形状来区分：环状和线性，环状如M13、G4、

174

；四、单链DNA病毒的复制94第三章-遗传物质的复制2、单链环状DNA的复制第一阶段以亲本链（＋链）为模板合成互补的环状负链，形成闭合环状的复制形（RF1）。第二阶段以滚环复制（loopedrollingcirclereplication）产生多个子代RF；第三阶段以RF的负链为模板进行滚环复制产生多拷贝正链单环。95第三章-遗传物质的复制１）174的复制过程Φ

174RNA引物的合成需多个蛋白因子，这一蛋白复合物称引发体(primosome)；Φ

174有一个预引发位点，而引发位点有许多个；引发体在单链DNA上是沿着模板5‘-3’方向移动，同DNA合成方向相反；当引发体发现引发位点时就可以合成引物RNA，因此所复制的负链是由一系列冈崎片段组成，因此新生的DNA链是后滞链。负链合成96第三章-遗传物质的复制RF-I复制型通过滚环复制合成正链多拷贝A蛋白结合其识别位点并诱导富含A/T序列熔解；A蛋白在一特定位点切断磷酸二酯键，并与端裂的5‘核苷酸共价连接；在Rep、SSB和polIII协同作用下，(+)链的3’-OH不断延伸，5’端不断被置换；复制到起始原点序列时，A蛋白在此处将链切断，并环化。97第三章-遗传物质的复制2）M13噬菌体基因组除59bp序列的发夹结构外，其余均被SSB覆盖，发夹结构是起始信号；寄主RNA聚合酶在此结构前起始RNA引物合成（20-30碱基），发夹结构打开；SSB结合到发夹结构中未形成杂交链的部分，终止发夹顶端的转录；RNA引物被DNA多聚酶Ⅲ延伸，至RNA引物的另一端；DNA聚合酶Ⅰ的外切活性切除RNA，并填补空隙；缺刻最终由连接酶接上。98第三章-遗传物质的复制3、单链线性DNA的复制——细小病毒细小病毒反义DNA链的合成需借助于宿主细胞的RNA聚合酶和DNA聚合酶；细小病毒(+)DNA基因组两端有可通过折叠互补形成发夹结构的序列；3’端发夹可作为DNA复制的引物，合成互补链，经连接酶连接后形成环状DNA；发夹结构被特异性限制性内切酶切割后，得到线性双链DNA；双链阶段，反义链既可作为转录的末板，也可作为复制有义链的模板。99第三章-遗传物质的复制第五节真核生物的DNA复制

1、DNA甲基化：胞嘧啶C5位甲基化促使染色体结构解开，有利于复制酶和蛋白因子的结合；2、有多个复制起点，复制起点不是同时开启；复制起点也是变化的，发育活化的细胞有更多的复制起点；3、真核生物染色体在全部复制完成前，各复制起点不能进行新一轮复制；4、引发酶是DNA聚合酶的一个亚基；复制延伸阶段发生DNA聚合酶/转换。（一）真核生物DNA复制的特点100第三章-遗传物质的复制101第三章-遗传物质的复制（二）真核生物DNA复制酶和蛋白因子βγ102第三章-遗传物质的复制1、真核生物的DNA聚合酶和引发酶5’-3’103第三章-遗传物质的复制DNA聚合酶/引发酶负责两条链复制的引发；既具有聚合酶活性，也具引发酶活性，二者是偶连的；具有5’→3’聚合活性，无3’→5’外切酶活性，其功能RNA引物和起始DNA（iDNA）合成。104第三章-遗传物质的复制起始DNA（initiatorDNA,iDNA）

poly-引发酶在复制叉上首先合成RNA引物，长度8—12碱基，然后DNA聚合酶活性将RNA引物继续延伸，产生短的DNA序列，即起始DNA。

SV40复制起始研究显示poly-引发酶合成的引物RNA-iDNA长度约40nt，其中5’端RNA引物约10nt。DNA聚合酶转换

poly-引发酶缺乏持续合成DNA链的能力而离开模板DNA。其他DNA聚合酶利用RNA-iDNA引物，分别合成前导链和后滞链。105第三章-遗传物质的复制DNA聚合酶poly负责先导链合成和后滞链的持续合成；poly为二聚体，既有5’→3’聚合活性也有3’→5’外切酶活性，有校对功能；poly功能需要分裂细胞核抗原PCNA，PCNA可促进poly与模板-引物的相互作用。DNA聚合酶poly的结构与类似，酶活性也相似，都具有高度的持续合成能力；可能是负责复制后的修复或在由于复杂的拓扑结构造成的复制暂停位点起始复制。106第三章-遗传物质的复制2复制蛋白A（replicationproteinA,RPA）单链结合蛋白，RPA是DNA复制必需的；促进DNA进一步解旋，激活poly

引发酶活性，是组装引发复合体所必需的；RPA为三聚体，但单独亚基不具活性。3复制因子C（replicationfactorC,RFC）RFC具有依赖于DNA的ATPase活性，其活性被PCNA进一步激活；RFC的主要作用是促使PCNA环形分子结合模板-引物链，或者使PCNA结合在DNA双螺旋DNA的切口；RFC由5个亚基组成。107第三章-遗传物质的复制4分裂细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)PCNA是pol

的辅助蛋白，其功能是pol

的进行性因子，使pol

获得持续合成的能力；PCNA本身没有结合DNA的能力，在依赖于ATP的RFC的作用下，PCNA三聚体装载于DNA；PCNA是同源三聚体，可形成环形结构与双螺旋DNA紧密结合5

DNA解链酶解链酶在复制叉上沿着一条DNA链单向移动，使双链DNA分开成为模板；SV40中DNA解链酶是大T抗原；真核细胞染色体DNA复制的解链酶尚不清楚。108第三章-遗传物质的复制（三）真核生物DNA的复制过程1、DNA聚合酶

/的转换特异蛋白识别复制原点并结合，解旋酶促使原点解链；RPA结合维持单链状态并使解链区域向左右转移；poly-引发酶在RPA覆盖的单链DNA模板上合成RNA-iDNA引物；RFC结合于iDNA3’端，将PCNA装到DNA上，组装poly复合物，由其取代poly，发生聚合酶转换。109第三章-遗传物质的复制2、冈崎片段的成熟引物切除：RNaseH1/FEN1可利用前者的内切酶活性切割冈崎片段5’端RNA片段，留下的RNA-iDNA连接点旁的核糖核苷酸由后者的外切酶活性切除；间隙填补由poly或负责；片段的连接则由DNA连接酶I负责；参与冈崎片段成熟的蛋白均结合PCNA，受其协调；110第三章-遗传物质的复制研究表明前导链和后滞链的合成都需要poly-引发酶和poly，都会发生聚合酶的转换；转换出现在前导链的引发阶段，而在后滞链中发生于每个冈崎片段的合成之初；前导链和后滞链的合成在酶学上十分接近。111第三章-遗传物质的复制112第三章-遗传物质的复制Pol

113第三章-遗传物质的复制1、端粒（telomere)—结构与功能保守的亚细胞结构1）端粒是真核生物染色体末端的蛋白质-DNA结构，其功能是完成染色体末端复制，可防止染色体融合、重组和降解。（四）真核生物DNA的末端复制114第三章-遗传物质的复制2）端粒DNA：由短而数目精确的串联简单重复序列构成的结构，3’突出于5’，维持染色体的稳定性。人染色体端粒长度约15kb，由上千个TTAGGG组成，3’端富含GT。正常细胞中端粒DNA随着细胞的有丝分裂会逐渐缩短，而永生细胞中端粒长度是稳定的。115第三章-遗传物质的复制3）端粒结合蛋白酵母的端粒结合蛋白已分离到Raplp和ku两类；Raplp结合于端粒DNA，能限制端粒介导的延伸，当端粒长度达到一定阈值时，会负调控端粒酶活性，使端粒缩短。人的端粒相关蛋白TRF1,TRF2,tankyrase,UP1,TINF2TRF1的功能与Raplp相似，可以导致端粒变短；TRF2则可以防止染色体末端相互融合。116第三章-遗传物质的复制2、端粒酶（telomerase）1）端粒酶是一种自身携带模板的逆转录酶，能催化合成端区重复序列。端粒酶由RNA和蛋白质组成，是一种核糖核蛋白。2）RNA：单链，提供AAUCCC（哺乳动物）模板，指导短重复序列（TTAGGG）合成；3）蛋白质：提供催化活性，人的端粒酶蛋白组分称为“人端粒反转录酶”（hTERT）。117第三章-遗传物质的复制118第三章-遗传物质的复制端粒酶的结构RNA亚基：二级结构有4个保守双螺旋，双螺旋I区最保守，其余三个双螺旋是茎环结构，是蛋白质结合区域。蛋白质亚基：是端粒酶的催化亚基，与RNA一起构成核心酶。人的该亚基长度为1132个AA,有7个与病毒逆转录酶相同的结构域。119第三章-遗传物质的复制4）端粒酶活性一般存在于：生殖细胞，包括胚胎干细胞；癌细胞；单细胞真核生物，如四膜虫；有时在细胞循环的S期，即染色体合成时期端粒酶也有短暂表达。120第三章-遗传物质的复制121第三章-遗传物质的复制3端粒酶的复制机制122第三章-遗传物质的复制端粒酶RNA模板与端粒DNA3’端杂交，以其RNA内的3个碱基AAC为模板，在端粒DNA末端加TTG；端粒酶转位到端粒的新3‘端，模板RNA的AAC序列与端粒新合成的TTG配对；端粒酶利用RNA为模板，再加6个碱基GGGTTG到端粒3’端；通过易位与延伸，反复地将重复片段加到富含G的突出的3‘端上；当富含G链达到一定长度，引发酶能合成RNA引物，与端粒富含G的链的3‘端互补；DNA聚合酶延伸合成DNA；RNA引物被去除，留下3’突出端。123第三章-遗传物质的复制端粒复制