新乡医学院法医物证学实验指导

新乡医学院

法医物证学实验指导

（试用版）

基础医学院法医物证学教研室

2007年1月

法医物证学实验指导

（试用版）

主编：黄艳梅

编者：（按姓氏笔画为序）

王克杰武红艳尚万兵黄艳梅

基础医学院法医物证学教研室

2007年1月

法医物证学实验室规则

一、学生在实验课中应该努力学习，培养严肃认真的工作作风，科学、客观、细致和

求实的工作态度，一丝不苟的工作精神。鼓励学生在老师的指导下，利用实验室条件

开展业余科研活动和探索创新实验。

二、遵守实验室管理条例，不迟到，不早退，不无故缺课，有事时需按规定程序事先

请假，严重违规者按学校有关条例处理。

三、实验中应该掌握实验原理，严格遵守各项实验操作程序，培养对实验结果的独立

分析和发现问题的能力。

四、使用实验室仪器，必须在老师的指导下严格按仪器操作规程进行，贵重仪器必须

在老师的指导下使用。不按操作规程使用造成的仪器损坏，当事人必须赔偿。

五、防止污染是法医物证实验室的重要原则，对实验的每一个细节都应有防止污染的

意识，例如：在操作空间和使用器械时应将PCR前利PCR后严格区分开、在加样区

域应定时紫外线照射（使用265mm波长）减少DNA污染、使用一次性Tip和Eppendorf

管、实验中常规设立阴性对照和阳性对照等等。

六、在法医物证检验中，由于所检测的对象是血液（痕卜精斑等生物检材，存在传播

肝炎、爱滋病等疾病的潜在危险，在实验中也会接触到许多有害物质，如丙烯酰胺、

澳乙锭等试剂，因此要注意自我保护。进入实验室须穿工作服，操作时应戴一次性手

套，实验结束后要做好清洁工作。

七、实验室内应保持安静和良好秩序，不可在实验室内吃东西，不许嬉戏打闹。

目录

第一部分DNA检验.....................................................-1-

实验一DNA提取.......................................................-1-

实验二DNA的浓度测定一紫外分光光度法................................-8-

实验三PCR-STR分型技术..............................................-10-

实验四其它法医DNA检验...............................................21

第二部分生物检材的确证..................................................27

实验五血痕检验........................................................27

实验六精斑检验........................................................34

实验七唾液斑检验.......................................................40

实验八毛发检验.......................................................-43-

实验九组织脏器碎片的检验..............................................45

第三部分ABO血型检验....................................................46

实验十抗A、抗B、抗H抗体的效价测定及标化...........................46

实验十一新鲜血液ABO血型检测........................................48

实验十二吸收试验.......................................................51

实验十三中和试验.......................................................54

实验十四解离试验.......................................................56

第四部分亲子鉴定和个人识别的结果分析...................................60

实验十五亲子鉴定和个人识别的概率计算.................................60

第五部分法医学鉴定书的编写.............................................66

实验十六法医学鉴定书的编写............................................66

第六部分法医物证检材的提取、保存与送检..................................69

实验十七法医物证检材的提取保存送检....................................69

第一部分DNA检验实验•DNA提取

第一部分DNA检验（DNAtest）

实验一DNA提取（theextractionofDNA）

［目的与要求］掌握酚/氯仿法、Chelex-100快速抽提法和改良碱性裂解法提取生物检

材DNAo

［实验仪器与试剂］

1.仪器设备：0.5/1.5mlEP管，各种规格移液器、离心机、剪刀、水浴锅。

2.试剂：

5%chelex-100：称取5gchelex-100,加高压灭菌ddH2。100ml。

10mg/ml的蛋白酶K

20mmol/L的DTT

下标横线的试剂配制请参见本实验附页P76。

一、酚/氯仿法

［原理］真核细胞在去垢剂SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K作用下消化破裂真核细

胞膜与核膜，核蛋白质变性并降解，释放DNA。通过有机溶剂酚和氯仿，除去蛋白

成分，用乙醇沉淀收集DNA。

［操作］

（-）新鲜血液：

1.溶血

1）取待检血液504，置于1.5ml离心管中。

2）加入lx红细胞裂解液至约2/3离心管容积,盖紧后轻轻倒转混匀，约10min,

5000rpm离心5min,弃去上清。

2.消化

力口STE溶液400uL10%SDS40ul,10mg/ml蛋白酶K6可，56℃孵育3〜6h,

间或倒转、摇匀。

3.DNA提取

1）加等体积饱和酚，混匀10min,5000rpm离心10min,转移水相至新管。

第一部分DNA检验实验•DNA提取

2）加等体积饱和酚/氯仿（1：1）,混匀5min,5000rpm离心10min,转移水相

至新管。

3）加等体积氯仿，混匀5min,5000rpm离心10min,转移水相至新管。

4.沉淀DNA

1）加1/10体积的3mol/1NaAc及2倍体积预冷无水乙醇,封盖，轻轻来回倒置

摇匀，即可见白色絮状DNA析出。

2）4℃12000rpm离心10min,弃去上清。

3）加入预冷70%冰乙醇，4℃12000rpm离心10min,洗涤DNA,弃上清，去

除残留的盐。

4）重复步骤3）,沉淀在室温下挥干。

5,溶解DNA

加入1XTE（pH8.0）溶液约300gl溶解DNA,4℃保存备用。

（―）血痕

1.取血纱约5X5mm2,剪碎后置于1.5ml离心管中。

2.以下步骤同（一）2〜5。

（.=）人及动物软组织：

1.组织预处理：取约绿豆大小组织，剪碎后置于1.5ml离心管中。

2.以下步骤同（一）2~5。

（四）唾液（斑）或口腔拭子：

1.唾液斑或口腔拭子细胞洗脱：

1）取唾液斑约0.5〜1.0cn?或口腔拭子2支，置于isml离心管中，剪碎后加入

STE浸泡数小时，其间经常摇动。

2）5000rpm离心3min,小心吸去上清，仅保留30（11左右的液体。

2.以下步骤同（一）2〜5。

（五）精液（斑）DNA提取：

1.精液（斑）预处理：

取精液104或精斑OST.Ocn?置于1.5ml离心管（后者需要剪碎）。

2.消化:

-2-

第一部分DNA检验实验•DNA提取

加入STE400W，10%SDS60pl,10mg/ml蛋白酶K8pl,1mol/LDDT20pl,

569孵育过夜，期间注意倒转、混匀。

3.以下步骤同（一）3〜5。

（六）混合斑或阴道拭子DNA提取（二步消化法）：

1.混合斑或阴道拭子预处理：

1）取混合斑或阴道拭子，置于1.5ml离心管，加入STE浸泡数小时，不断翻动。

2）5000rpm离心10min,弃去上清。

2.第一步消化：

1）加入STE400W，10%SDS40gl,蛋白酶K（10mg/ml）10位,37℃孵育3~6

h,间或倒转,混匀。

2）5000rpm离心10min,上清液保留备用。

3.第二步消化：

取第一步消化后的沉淀中加入STE400pl,10%SDS40ml,10mg/ml蛋白酶K10

gl,1mol/LDTT20pl,56℃孵育过夜，期间注意倒转混匀。

4.分别取第一步消化液及第二步消化液提取DNA,步骤同（一）3〜5。

（七）毛根：

1.毛发预处理：

1）取5根拔取的毛发（有毛囊），将毛干剪碎，放入0.5ml离心管。

2）用无水乙醇洗一次。

2.消化：

毛发晾干后加入STE100W，10%SDS10川，10mg/ml蛋白酶K3R1,混匀，放

置55C水浴3h或37℃孵育过夜。

3.以下步骤同（一）3〜5。

（八）毛干线粒体DNA提取：

1.毛干清洗：

1）取5根拔取的毛发，将毛干剪碎，放入0.5ml离心管。

2）用无菌水、无水乙醇分别浸泡两次，每次10min。

2.消化:

-3-

第一部分DNA检验实验•DNA提取

晾干后加入STE64W，10%SDS20可，10mg/ml蛋白酶K8可，1mol/LDTT8pl,

混匀，37℃温浴消化过夜。

3.以下步骤同（一）3〜5。

（九）指甲：

I.指甲清洗：

1）将指甲剪碎后装入0.5ml离心管中。

2）用无菌水、无水乙醇分别浸泡1次，每次10min„

2.消化：

晾干后加入STE400nl,10%SDS40W，10mg/ml蛋白酶K15僦，1mol/LDTT8

W，混匀，37℃温浴消化过夜。

3.以下步骤同（一）3〜5。

（十滑组织

1.较新鲜的骨骼

1）取骨碎块分别用冷蒸储水、乙醇浸泡15min；晾干后用研钵磨成骨粉。

2）取骨粉（骨松质10-20mg,骨密质75-100mg再用乙酸脱脂后）加入STE400pl,

10%SDS40|ib蛋白酶K（10mg/ml）15可，混匀。37℃孵育消化过夜；以下步骤同（一）

3~5。

2.陈旧骨骼：

1）按（十）1.1）方法制成骨粉，取5g骨粉加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）40ml,4℃

混匀24~48h。5000rpm离心15min,弃上清。

2）加入STE使终体系达7ml,再加入10mg/ml蛋白酶K20比37℃孵育12h。

3）以下步骤同（一）3〜5。必要时用Centricon（公司名）柱层析法浓缩。

［注意事项］

1.提取过程中应缓慢上下转动试管混匀，切忌动作粗暴，以免人为打断DNA分子。

2.毛发、骨骼、指甲等检材作DNA抽提时，要尽量使用活性好的蛋白酶K。配置的

蛋白酶K应在短时间内用完，暂时不用时要放于40。

3.酚和氯有强腐蚀性，可对皮肤、粘膜、眼睛等造成损伤。氯仿极易挥发，易燃易爆,

具有麻醉作用及神经毒性，操作时必须戴手套。

-4-

第一部分DNA检验实验•DNA提取

4.苯酚易被氧化，配制饱和酚时须加入还原剂8-羟基嘎琳，装于棕色瓶4℃保存。当

溶液变成粉红色时，不能再使用。

5.DNA提取过程中液体转移时管子要标记明确，切勿弄混标本。使用一次性已消毒

的Tip、离心管，切忌DNA相互污染。

二、Chelex-100快速抽提法

［原理］Chelex_100是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯多聚体组成，含有成对的亚

氨基二乙酸盐离子，起着螯合基团的作用。对多价金属离子有极强亲和力。在低离子

强度、碱性及100℃煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与DNA结合的蛋白质变

性，游离DNA。Chelex-lOO螯合剂吸附了金属离子后，能够抑制核酸酶对DNA的消

化作用。

［操作］

（-）新鲜血：

1.取新鲜血50可，置于0.5ml离心管中；

2.加入1X红细胞裂解液至约2/3离心管容积,轻轻倒转混匀，约10min,

5000rpm离心10min,弃去.上清；

3.重复步骤（2）；

4.加5%Chelex-100约200HL轻倒转、混匀,56c孵育0.5〜2h,旋涡振荡5〜10s。

5.98℃孵育8~10min,旋涡振荡5~10s；

6.10000rpm离心2min,取上清液作PCR扩增反应。

（二）血痕：

1.剪取血纱约5X5mm?,置于0.5ml离心管中；

2.血纱色泽较深，可加1X红细胞裂解液浸泡10〜15min,至血纱颜色变淡，浸泡

液变为浅红色，10000rpm离心5min,弃上清，保留20ul左右液体和载体；血纱色较

浅，可直接进入下--步骤；

3.其余同（一）4〜6。

（三）人及动物软组织：

1.取约绿豆大小组织，剪碎，置于0.5ml离心管中；

2.加5%Chelex-100约200可，10mg/ml蛋白酶K6孤,轻轻倒转、混匀,56℃孵

-5-

第一部分DNA检验实验•DNA提取

育3h,旋涡振荡5〜10s。

3.以下步骤同(一)5〜6。

(四)毛发DNA提取：

1.拔取5根毛发(有毛囊)，剪碎后置于0.5ml离心管；

2.加入5%Chelex-100200W，蛋白酶K(10mg/ml)6可，56℃孵育过夜，期间倒转、

混匀；

3.98℃孵育8〜10min;

4.旋涡振荡约10s,10000rpm离心2min,上清液作为PCR的模板。

［注意事项］

1.本法仅适用于PCR反应模板的制备，DNA模板的保存时间较酚/氯仿法短。

2.操作中振荡步骤需要充分。

3.可根据检材情况适当延长56℃孵育时间。

4.煮沸(98℃)过程很关键，温度、时间要足够。

5.Chelex-100放置后会沉淀，使用前必须要摇匀。用Chelex-100提取的DNA模板如

放置很长时间或从一个实验室携带到另•个实验室检验，扩增前应混匀后再离心，取

上清液。PCR反应体系内绝对不能含有Chelex-100树脂颗粒。

三、碱性裂解法提取生物检材DNA

［原理］在强碱作用卜.，使构成细胞膜的蛋白质变性，肽键断裂快速破坏蛋白质的•级

结构(水解蛋白质)。因而在强碱性及一定温度状况下能迅速破碎细胞及核膜，并使核

酸酶变性,释放DNA。

［操作］

()新鲜血：

1.取混匀的枸椽酸钠抗凝血20可，置于0.5ml离心管中；

2.加入消毒ddH2O至约2/3离心管容积，轻轻倒转混匀，室温放置1min,8000rpm

离心7min,弃去上清；

3.加0.2mol/LNaOH20Hl溶液，混匀，30℃^W5min；

4.加I0.04mmol/LTris-HCl(pH3.0)180pl,混匀，8000rpm离心7min,上清液作

为PCR的模板。

-6-

第一部分DNA检验实验•DNA提取

(-)血痕：

1.剪取血纱约2X2mn?,置于0.5ml离心管中，加入dd出0至约2/3离心管容

积，轻轻倒转混匀，室温放置10min,8000rpm离心7min,弃去上清；

2.力口0.2mol/LNaOH20ul,80℃孵育lOmin,混匀；

3.力n180可0.04moi/LTris-HCI(pH3.0),8000rpm离心7min,上清液作为PCR

的模板。

(.=)精斑、毛发、唾液斑DNA提取方法与血痕相似。

［注意事项］对于较陈旧的血痕检材，可适当延长80℃的孵育时间。

［思考题］

1.比较三种DNA提取方法的优缺点。

2.精斑提取DNA采用二步消化法的原理和注意事项有哪些？

-7-

第•部分DNA检验实验二DNA的浓度测定

实验二DNA的浓度测定一紫外分光光度法

（ThequantificationofDNA）

［目的与要求］掌握紫外分光光度法测定DNA浓度和评估DNA纯度。

［原理］在以紫外分光光度计测定样品的光密度时，核酸的最大吸收峰在260nm处，

而蛋白质的最大吸收峰则在280nine因而在对样品进行光密度测定时不仅可测定其浓

度，同时可以通过OD260/OD280的比值估计DNA的纯度。

［实验仪器与试剂］

1.仪器设备

UV-mini-1240紫外分光光度仪

2.试剂

超纯水

［操作］

1.取DNA溶液4川，加入超纯水76川，轻轻混匀；

2.以超纯水作为空白对照，在紫外分光光度计上测定标本的OD260值和OD280值；

3.DNA浓度按照以下公式计算：

DNA浓度（ng/m）：（OD260值X50X50）/1000

4.DNA纯度按照OD260/OD280比值进行估计，若比值大于1.6,说明：DNA样品比

较纯;若比值小于1.6,则说明蛋白质或其它杂质存在，这样的DNA样品不宜于作分

子生物学实验。

［注意事项］

I.每次检测前后必需将比色杯清洗干净。

2.如DNA样品中含有定RNA。用本方法测得的DNA含量不准确。

3.每项次操作均需用稀释液设置对照，在260nm和280nm处校零。测定双链DNA

则选择超纯水作为稀释液，测定单链DNA选择0.4mol/L,NaOH作为稀释液。核

酸浓度和吸光度间的关系如下：

1）双链DNA：

10D双链DNA=50ng/ml

-8-

第•部分DNA检验实验二DNA的浓度测定

DNA浓度（ng4d）=（OD260值X50X稀释倍数）/1000

2）单链DNA：

10DA260单链DNA=40pg/rnl

DNA浓度（ng/nl）：（OD260值X40义稀释倍数）/1000

［思考题］

1.采用紫外分光光度法测定DNA浓度的原理是什么？

2.还有哪些方法可以测定DNA浓度？

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第•部分DNA检验实验三PCR-STR分型技术

实验三PCR-STR分型技术

(ThetechniqueforPCR-STRgenotyping)

［目的与要求］掌握PCR-STR银染分型技术及实验结果分析，了解PCR-STR自动分型

技术。

［原理］STR由2〜6bp的核心序列串联重复组成，其重复次数具有多态性(在许多情况

下，其核心序列也有变异)。

［实验仪器与试剂］

I.仪器设备

PCR扩增仪、电泳仪、ABI3130

2.试剂(配制见附表)

超纯水、TaqDNA聚合酶、引物、dNTP、基因组DNA、6%聚丙烯酰胺凝胶>10%APS、

TEMED、10%乙醇、1%硝酸、AgNCh溶液、显色液10%冰乙酸、甲酰胺、6Xloading

buffer>GS500o

［操作］操作流程图解

各种检材

I

DNA提取

1

STR位点的单一或复合扩增

1

垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物

11

银染法荧光标记自动分析

-垂直聚丙烯酰胺凝屐光标记检测法：377型

—毛细管电泳自动分析：310、3100型

1

结果b网，数据分析

一、垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法

［原理］聚丙烯酰胺凝胶(PAG)由丙烯酰胺(Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)聚合而成。在

-10-

第•部分DNA检验实验三PCR-STR分型技术

凝胶聚合中，丙烯酰胺单体分子中的双键先打开，相互连接形成脂肪族长链分子，再

由交联剂亚甲基双丙烯酰胺随机地与长链上的游离功能机团反应，构成三维网状结构

的凝胶。打开丙烯酰胺双键必需的自由基由引发剂过硫酸筱(APS)提供。凝胶聚合反

应的催化剂为四乙基乙二胺(TEMED),

描述聚丙烯酰胺凝胶物理特性使用两个技术参数：凝胶浓度(T)和交联度(C)。计算

公式如下：

T=a+b/VX100%C=b/a+bX100%

式中a是Acrg数，b是Bisg数，V是凝胶总体积(ml)数。

凝胶孔径大小主要与凝胶浓度有关，当交联度恒定时，T越小凝胶孔径越大，T

越大孔径则越小。交联度C值与凝胶孔径的关系呈抛物线函数关系。C为5%时;凝

胶孔径最小，平均直径大约20nm,低于5%或高于5%时凝胶孔径增大。

在pH8.0-pH8.3的介质中，核酸分子带负电荷，向正极泳动。对于线形双链DNA,

分子量的对数与电泳迁移率成反比例关系，据此可检测DNA片段长度多态性。

银染法的原理是利用银离子(Ag')或氨银络离子(［Ag(N比)2『)的状态，渗入凝胶

中与DNA分子结合成稳定的复合物。然后用甲醛作为还原剂使金属银析出，呈现黑

褐色银沉淀而现显出DNA分子条带。

［操作］

一、检材处理(见实验一)

二、PCR反应

(-)引物名称及序列：

D3S1358：

forward:5'-ACTGCAGTCCAATCTGGGT-3'

reverse:5'-ATGAAATCAACAGAGGCTTGC-3'

D5S818：

forward:5'-GGTGATTTTCCTCTTTGGTATCC-3'

reverse:5'-AGCCACAGTTTACAACATTTGTATCT-3'

(—)反应体系：

1.PCR混合液准备：

1)反应体系含有成份(见下表)：

-11-

第•部分DNA检验实验三PCR-STR分型技术

2）计算所需要试剂的量：每一反应管所需的量X（所要分析的样品数+3）。多出的3份

是：一份用于阳性对照，一份用于阴性对照：另•份用于补偿加样过程中的损失。

3）PCR混合液加样顺序：超纯水、10X缓冲液、引物、TaqDNA聚合酶。

2.标记反应管，每反应管中分装入20川的PCR混合液。

3.按照标记加入5川DNA提取液，同时加5M超纯水到阴性对照管中，加已知

STR分型的DNA到阳性对照管中。关闭管盖，瞬时离心数s。

成分浓度量

10X缓冲液(buffer)2.5pl

单核甘酸（dNTPs）0.2mol/L2.5

引物(Primer)各0.1[1mol/L2pl

TaqDNA聚合酶0.5U0.25gl

模板DNA10-100ng5gl

超纯水H2O加至25gl

（三）将反应管放入PCR仪中，设定PCR反应的循环参数，进行扩增:

94℃45s1

941c4minT60"C40s-30个循环，72（末次延伸lOmin

72ss，

三、扩增产物的分离：中性聚丙烯酰胺凝胶电泳（C=6%,T=3.3%）（polyacrylamidegel

electrophoresis）

1.选板：选择合适的垂直电泳槽与大小相配的两块玻璃板（其中一块有凹口），及两玻

璃板间隔垫片和鲨鱼齿梳（其厚度应与间隔片相配套）。

2.擦板：用无水乙醇擦洗干净上述两块玻璃板，待其自然晾干。

3.装板与封边：在两块玻璃板间放好间隔垫片，用宽透明胶将玻璃板的两测及底边封

严，在玻璃板两边夹好夹子。

4.配胶：（注意丙烯酰胺有神经毒作用，操作时要带手套）

-12-

第•部分DNA检验实验三PCR-STR分型技术

旦

成分里

30%丙烯酰胺贮存液(Acr:Bis=29：1)7ml

5XTBE7ml

10%过硫酸镂(APS)150pl

四甲基乙二胺(TEMED)15pl

DDH2O补至35ml

凝胶板大小为18X30cm,厚度0.4mm,恒电压400V,电流25mA,电泳150min。

5.灌胶：胶液配好后，充分混匀，用负压机抽吸，以去除胶液中的空气，将玻璃板倾

斜•，缓慢灌入胶液(注意：灌胶时应连续，避免产生气泡，有气泡要及时清除)，胶液

灌好后，在玻璃板上方反向插入鲨鱼齿梳。

6.聚胶：在25〜28'C下让凝胶聚合约1〜2鼠

7.配制电极缓冲液：配制400ml电泳上槽液及400ml电泳下槽液，分别加入到上下

电泳槽中。

8.安装电泳槽：去掉封口的胶带以及玻璃板两边的夹子，小心拔下梳子，然后正向插

入鲨鱼齿梳，将胶板用固定夹固定在电泳槽上(有凹口的玻璃朝向电泳槽)，接通电源(注

意：负极接上槽，正极接下槽)，300V预电泳lOmin。

9.上样及电泳：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时,在待上样的DNA样本中加入适量的

6X非变性上样缓冲液(loadingbuffer),混匀后上样(注意：上样前要冲去鲨鱼齿梳间的

碎胶和气泡。而且上样速度尽量快些，以免样品扩散)。上样结束后，450〜500V恒电

压电泳，待二甲苯月青指示剂电泳至合适的位置后停止电泳。

四、用银染法显色：电泳结束后取下胶板，小心掀开玻璃板，移去间隔垫片，将凝胶

小心移入•托盘内，按以下步骤染色：

1.10%乙醇固定10min,蒸储水清洗1次：

2.1%HNC>3浸泡5〜10min,蒸储水清洗1次；

3.12mmol/LAgNCh染色15min,蒸储水清洗2次：

4.显色液显色10~30min；

5.10%乙酸停显1min。

-13-

第•部分DNA检验实验三PCR-STR分型技术

6.置于与凝胶面积大小相当的滤纸上，放入干燥箱中烘干。

［注意事项］

1.PCR各环节均要有防止污染的观念，并同时设立阳性与阴性(空臼)对照进行监测。

2.TaqDNA聚合前使用时要在冰浴中操作，使用后要及时放入-20C冰箱保存。

3.保证凝胶聚合均匀的最佳温度为23〜25℃,温度降低会明显减慢凝胶聚合，相反

温度升高会加速凝胶聚合。

4.增加APS或TEMED用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶变得脆弱而失去

柔性。

5.TEMED极易被氧化而失去催化能力，试剂中若污染有氧化剂杂质，溶液呈黄色。

如果无法得到无色透明的试剂，只有适当增加用量以保证凝胶聚合速度。APS容易吸

潮，溶解于水后很快降解并失效，所以APS应避光、干燥、密封条件下保存，溶液要

新鲜配置，4℃条件下保存不宜超过一周。

6.显色液需新鲜配制，棕色瓶保存。

二、荧光自动分析方法

(-)聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳荧光标记检测法(PE377测序仪)

［原理］荧光染料含有共扼双键易吸收激发光而变成不稳定的高能态(激发态)，当跃迂

回基态时:多余的能量会以发射光的形式释放出来。在PCR反应时将荧光染料标记

在引物，使扩增产物片段带有荧光信号，电泳分离时用荧光扫描检测DNA片段，再

转换成波峰。采用不同颜色的荧光可对扩增片段重叠的STR位点复合扩增，从而提高

检测的分辨率。

［材料］

(1)水：对所有试剂、凝胶、缓冲液，使用18MC的纯水或相当质量的去离子水。

(2)丙烯酰胺：LONGRANGER公司的50%丙烯酰胺溶液贮液，或Bio-Rad的19：1

聚丙烯酰胺溶液，室温保存。

(3)尿素：分析纯级。

(4)1出/硼酸在口1人缓冲液：使用分析纯级。EDTA必须是二钠盐，pH为8.3±0.1。

(5)TEMED：分析纯级，避光保存。

(6)过硫酸锈：分析纯级，配置10%(w/v)的贮液，配制的液体使用不超过I周。

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第•部分DNA检验实验三PCR-STR分型技术

(7)甲酰胺：去离子，冰冻保存。

(8)PCR引物：可以自己合成或购买，每一个基因座只须一条引物进行荧光染料标记。

引物必须是HPLC-纯化，分装成少量，避光保存在-20℃,避免反复冻融引起降解。

［操作］按照试剂盒说明进行DNA提取(3川全血加入0.5mlEppendorf管。加入

Chelex-1002003快速提取DNA),PCR按不向的试剂盒采取不同的PCR方案，上机

分析步骤如下：

I.凝胶的准备和仪器的开启与设置

(1)凝胶的准备

①洗板：用滤纸擦去玻璃板上的凝胶，用水浸泡玻璃板，用中性洗涤剂轻轻擦拭玻璃

板表面，然后用大量流水冲洗，直至玻璃板上不留任何杂质，最后用超纯水冲洗玻璃

板，置于清洁通风处自然晾干。

②装板：一玻璃板完全干后，将其安装在模架上，玻璃板的凝胶面朝里，板下上带字

的•面朝外，保证制胶模具包括夹条、梳子都正确配套。

③制配胶液：变性聚丙烯酰胺凝胶液，以7moi/L尿素作为变性剂，1XTBE为缓冲液。

按所需凝胶浓度和用量配置凝胶液，尿素必须完全溶解，丙烯酰胺凝胶溶液应当天配

制当天使用，用0.2gm.的滤膜过滤并负压抽气处理，灌胶后将梳子平端插入胶中，

在室温下放置2h,使凝胶充分聚合。凝胶液的配置：

(T=5%,总体积20ml)

成份里

尿素(Urea)9.6g

凝胶母液(Longranger)(30%)4ml

5XTBE4ml

TEMED150pl

10%APS10pl

(2)仪器的准备和软件的设置

①先开启测序仪和计算机电源，启动合适的基因扫描收集和分析程序，设置电泳参

数，如收集方式、梳子大小、电泳时间等。电泳条件•般选为3000V2.5h,选择收集

方式，确定滤光片种类，这取决于所用的荧光染料，PE公司的ProfilerPlus及Cofiler

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第•部分DNA检验实验三PCR-STR分型技术

Plus试剂盒使用PlateCheckA方式，Promega公司的PowerPlex.16)及PowerPlex1.2试

剂盒采用PlateCheckA模式。

②关闭其它应用程序，保证计算机有足够大的内存空间。因为计算机内存可用空间

越多，系统越安全，否则易发生“死机”现象，丢失数据。

(3)凝胶的安置与预电泳

①安置凝胶板：用略湿的干净纸巾或滤纸擦去凝胶玻璃板外表面的凝胶、尿素结晶

等，尤其是激光扫描口周围的脏物，否则扫描的凝胶基线会很高，干扰数据记录。清

洁完玻璃板后，将凝胶玻璃板安装到机器上。

②检测凝胶板：点击“PlateCheck”进行玻璃板扫描检查，正常条件下基线平整达到

要求时、将•1XTBE电极缓冲液加在电泳槽中，用注射器吸取1XTBE液轻轻冲洗凝

胶的加样孔，除去凝胶加样孔上面的尿素。

③预电泳：点击“Prerun”预电泳10~15min,使温度升至51℃,电流下降到约15mA

时,点击“Pause”准备上样。

④设置样品表Gampiesheet)(>

(4)样品准备：按甲酰胺：葡聚蓝(5mg/ml)：红色荧光内标=5:1066比例混合成上

样缓冲液，取巾1上样缓冲液与Igl扩增样品混合成上样混合物，95℃变性2min后移

至冰水中骤冷，取1可用于上样。

2.上样

①停止预电泳，用缓冲液将凝胶加样端的凝胶颗粒、尿素等杂质去除干净后。将鲨

鱼齿梳子插入凝胶中1~2mm，保证梳子齿尖在同一水平线。

②按样品表中编排好的加样顺序将上述已变性的上样混合液加入加样槽中。

3.电泳

(1)再次检查设定的电泳参数，调入正确的样品表，选取正确的matrix文件(也可以不

选matrix)。点击“run”程序，命名并保存此RUN文件，机器开始电泳。电泳条件：

36cm,5%,3000V/60mA/200W

4.收集数据

电泳整个过程，从凝胶基线到片段经过检测器的全过程都可以在凝胶图象窗口得

到监测。电泳结束后可以得到全部等位基因片段的电泳图。

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第•部分DNA检验实验三PCR-STR分型技术

5.数据分析

(1)进入GeneScan3.1程序。

(2)对道：电泳结束后，打开“gel”文件，调整电泳泳道追踪线标定样品加样泳道。

377平板凝胶电泳的每泳道电泳状态不同，可能出现带的弯曲或漂移，计算机自动

划线与数据提取可能有偏差，需要校正。

(3)提取凝胶：划完线后，在“gel”窗口选择“extractLane”提取凝胶文件，提取后

计算机自动显示分析屏幕。

⑷安装正确的"matrix”文件：在分析屏幕，点亮"sampleFile”栏，安装正确的"matrix”

文件。

(5)输入或定义内标分子量：在“sizeStandard”选择正确标准分子量内标。ROXGS500

分子量大小为75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、和

500»

(6)自动分析：点亮蓝色、绿色、黄色及红色道，点击“analyze',机器开始，进行自

动分析，获得染色谱带相对迁移率的电泳踪迹图和标明片段大小的表，并自动保存为

带“n”的文件。

6.等位基因分型

(1)打开Genotyper软件，在"File"菜单中点击“ImportGenescan”,将基因扫描分析

的结果输入，点击“checkGS500”检查内标。

(2)自动分型：双击左下窗口的“kazam"，机器自动进行等位基因分型。

［注意事项］

1.洗玻璃板时避免用纸巾擦干，以免在玻璃板表面留下擦痕和异物。玻璃板一定要洗

干净，否则所灌制的凝胶不均匀，带易扩散或拖尾，分离效果差，而且凝胶易发胀，

使谱带弯曲。如果在激光检测器处玻璃板没有洗干净，本底会很高，影响样品检测，

结果不可靠。

2.葡聚蓝为示踪染料，以便加样时能看得清楚。甲酰胺为变性剂，密度为1.13g/ml,

有利于上样。

3.引物是由荧光标记的，引物及PCR扩增产物必须避光保存。

4.电泳时泳道间样品有可能渗漏，故案件中的比对样品不能加在相邻的泳道内。

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第•部分DNA检验实验三PCR-STR分型技术

5.调节样品上样量，保证DNA电泳条带的荧光强度落在检测器线性范围内(40〜4000

Rfu)。如果上样量太多，会出现pull—up峰，波峰(带)变宽。对于较浓的PCR产物，

可用超纯水10倍稀释产物。对于荧光强度低于150Rfb的峰，解释结果要慎重。

6.样品必须完全变性(95℃,2min),并立即将变性后的样品放在冰水浴中以防复性。

否则，内标会出现杂带，样品出现额外峰，影响结果判定。样品变性时间不宜过短或

过长，过短DNA变性不完全，过长的变性使DNA片段拖尾，荧光峰变得钝而宽，降

低分辩率。

7.建立一个分析条件(仪器、试剂等)专一的matrix文件。进行另一个终端计算机分析

数据时必须注意使用与结果一致的matrix文件。

8.自动分型软件设定的分型的分子量误差为±0.5bp,当样品等位基因片段大小与

ladder相应的等位基因大小误差在±0.5bp范围内，计算机自动正确标定样品等位基因

型，而对于误差超过±0.5bp,计算机就不能确定等位基因分型，显示“OLladder”，

此时需分析人员的介入，进行人工干预，比较样品等位基因片段与Ladder究竟相差多

少，确定基因型。必要时须进行重新检验。

(二)荧光标记毛细管电泳检测法(3130型)(CapiHiaryElectrophoresis,简称CE)

［原理］毛细管电泳采用液体凝胶，可以自动灌注，结合激光扫描技术，提高了DNA

分型速度和自动化水平。

［材料］毛细管、POP4液体胶，电极缓冲液。

［操作］

1.开机:先打开电源,后开电脑。运用ABIPrism3130收集软件(Collectlionsoftware),

在window菜单中选menucontrol下运行X~Y轴，Z轴与注射器(styinge)回归位。

2.装置准备

①安装电极：在首次使用装置或电极严重变形时需安装新电极。在Z一轴回归位时,

修剪电极下端使之与样品盘(stripperplate)下端平齐。

②安装毛细管：用擦镜纸沾少量95%乙醇擦拭毛细管上的激光窗口，固定毛细管，

正极端使之处于注射器下端的十字接口处，负极端与电极平行，其下端超过电极0.5

mm即可。根毛细管原则上可进行100次电泳。如果使用者维护较好，可延长其使

用寿命，可高达1000次。但随着使用次数增加，背景信号(噪音)会增加。

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第•部分DNA检验实验三PCR-STR分型技术

③校正样品盘位置：以毛细管为中心，高速前后点(此步骤在更换电极后需要)。

④安装注射器：先用去离子水洗1.0ml注射器，再用0.2pop—4胶液湿润内壁，弃

取胶液。重新灌进0.5pop-4胶液并排空注射器内气体，装注射器至灌胶泵上，并排空

其下管道气体。

⑤在window菜单手动控制选择syringedown,使注射器泵外刚好进入到注射器上端。

⑥配制1XGAB(遗传分析仪缓冲液，Geneticanalyzerbuffer),并分装到正负极的缓

冲液管里，其中正级的管内装9ml,负极4ml。

3.设置分析参数

运行Genescan分析3.1软件，在设定莱单(settingmenu)中选择分析参数，设置

如下：分析范围(AnalysisRange)：2400~7000

数据处理(Dataprocessing)：B：150,G：150,R：150

最小峰半宽(minpeakhalfwidth)：3pts

大小范围(SizecallRange)：75~500bp

裂开峰校正(Splitpeakcorrection)：none

校正范围(Correctionlimit)：30Datapts

设置完毕，退出Genescan,分析软件，运行collectiono

这一步骤在机器开始使用时设定，以后不需要再设定。

4.设置电泳温度

在GSSTRpop4(lml)F运行下，在手动控制下设定温度为60℃,进样时间一般

为5s~10s,以控制进样量。

5.样品准备

按去离子甲酰胺：GeneScan~500[ROX]分子量标准物=24：1混合两者，离心，取

混合液25可，再加入1.53扩增产物或等位基因分型标准物(allelick1dder)l.5W，或

按甲酰胺：GeneScan'500[ROX]：PCR产物=12：0.5：1混合混匀，离心，置95℃变

性3min,置冰水浴至少3min。

3130毛细管电泳系统使用的是电动注射加样，为了得到足够的信号强度，应当取

与ABI377仪相似的样品和标准量。

6.设置样品表(samplesheet)与进样表(injectionsheet),进样时间，电泳时间，开始电

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第•部分DNA检验实验三PCR-STR分型技术

泳，收集数据。

电泳时间一般为24min,对于使用次数较多的缓冲液（一般要求电板缓冲液使用

不超过两次），要求延长电泳时间到26min,否则有可能有部分等位基因尚未通过激

光扫描检测窗口，数据收集不到。

DNA样品进入毛细管中的速度与样品中的离子强度成反比。用下面二个方法可

以降低离子强度：（1）对样品进行透析去离子：（2）用去离子水稀释PCR扩增产物。

7.分析数据运行Genescan分析软件，标定内标Genescan~500［ROX］,进行分析。步

骤（同377测序仪）。注：只是分子量内标的250bp片段不要定义，跳过此片段。因为

此片段在310仪器上实际测定不是250bp。

8.关机

①取下毛细管，使其两端分别置于装蒸储水的1.5mlcppondorf管中；

②用去离子水清洁注射器；

⑨运行样品盘X-Y轴，Z-轴回归位；

④关闭电脑（先退出程序，后关主机）；

⑤关闭3130主机开关。

与ABI377测序仪一样，在开始使用或改变条件时需制作matrix文件。

［注意事项］

1.同AB1377测序仪“注意事项”3〜8。

2.使用前毛细管必须归位，用多聚胶液灌注毛细管时一定要将气泡排干净。

［思考题］

1.STR-PCR分型方法有哪些？

2.STR-PCR分型技术在法医学中应用有哪些优点？

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第•部分DNA检验实验四其它法医DNA检验

实验四其它法医DNA检验

(OtherforensictestsofDNA)

一、Amelogenin基因的性别测定

［原理］人类牙釉质蛋白Amelogenin的基因为X染色体与Y染色体所共有，由于存在

不同的碱基缺失，人类Amel—X与Amel—Y的内含子长度不同。针对Amelogenin

基因碱基缺失部位两侧的X、Y染色体同源序列设计引物，PCR扩增X、Y特异性片

段表现出长度差异，据此可进行性别鉴定。本实验是通过扩增Amelogenin基因第■

内含子片段检测X、Y特异性片段进行性别鉴定。

［实验仪器与试剂］见实验一和三

［操作］

(一)DNA提取见实验一

(-)引物序列

5,-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3,

5,-AYCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3,

(三)DNA扩增

在25僦反应体系中加入以下各组成份：

(1)10XReactionBuffer2.5川(500mmol/LKCl,100mMTris-H