《食品微生物检验技术》课件-几种常用的细菌染色法

几种常用的细菌染色法目录/Contents1简单染色法革兰氏染色法芽孢染色法染色2345荚膜染色法鞭毛染色法01简单染色法常用碱性染料进行简单染色原理

在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。01简单染色法1.简单染色法步骤：

01简单染色法（1）涂片

取干净的载玻片一块，滴一小滴生理盐水于载玻片中央,严格按无菌操作程序,挑取大肠杆菌或金黄色葡萄球菌于载玻片的水滴中,调匀并涂成薄膜。01简单染色法（2）晾干

让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方以文火烘干。（3）固定

手执玻片一端,让菌膜朝上,通过火焰2～3次固定（以不烫手为宜）。（4）染色

将固定过的涂片放在搁架上,加复红或结晶紫染色1～2min。（5）水洗

染色时间到后,用自来水冲洗,直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急,过大,水由玻片上端流下,避免直接冲在涂片处。（6）干燥

将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（7）镜检

先低倍镜观察,再高倍镜观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油一滴,将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。02革兰氏染色法革兰氏染色步骤：涂片→干燥→固定→结晶紫染色→水洗→吸干→95%酒精脱色→水洗→吸干→蕃红复染→水洗→干燥→镜检。（1）涂片

涂片方法与简单染色涂片相同。（2）晾干

与简单染色法相同。（3）固定

与简单染色法相同（4）结晶紫染色

将玻片置于玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min。02革兰氏染色法（5）水洗倾去染色液,用水小心地冲洗。（6）媒染滴加革兰氏碘液,媒染1min。（7）水洗用水洗去碘液。（8）脱色将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色20～30s至流出液无色,立即水洗。（9）复染滴加蕃红复染1～2min。02革兰氏染色法（10）水洗用水洗去涂片上的蕃红染色液。（11）晾干将染好的涂片放空气中晾干或用吸水纸吸干。（12）镜检镜检时先用低倍镜,再用高倍镜,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。03芽胞染色法芽孢染色步骤：涂片→固定→孔雀绿染色→水洗→干燥→观察。（1）将有芽胞的材料作涂片、干燥、固定。（2）将5％孔雀绿水溶液滴加于固定好的涂片上。用木夹夹住载玻片在酒精灯火焰上加热，使染料冒蒸汽（但不能煮沸），切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。加热时间从冒蒸汽时开始计算约4～5min。03芽胞染色法芽孢染色步骤：涂片→固定→孔雀绿染色→水洗→干燥→观察。（3）倾去染色液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。（4）用0.5％沙黄水溶液复染1min，水洗。（5）干燥或烘干后，置油镜观察，芽胞呈绿色，菌体呈红色。04荚膜染色法荚膜染色液：绘图墨水，1％甲基紫水溶液，1％结晶紫水溶液，6％葡萄糖水溶液，20％硫酸铜水溶液，纯甲醇等。(1)湿墨水法①制备菌和墨水混合液加一滴水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合均匀。04荚膜染色法荚膜染色液：绘图墨水，1％甲基紫水溶液，1％结晶紫水溶液，6％葡萄糖水溶液，20％硫酸铜水溶液，纯甲醇等。②加盖玻片将一洁净的盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。③镜检用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好。背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。05鞭毛染色法（1）硝酸银染色法①菌种的准备要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色。对于冰箱保存的菌种，通常要连续移种1-2次。良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。②载玻片的准备将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮约20min，取出用清水充分洗净，沥干后置95％乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。05鞭毛染色法7.鞭毛染色法（1）硝酸银染色法③菌液的制备取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1~2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。④制片取一滴菌液于载玻片上的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温（或37℃）自然干燥。05鞭毛染色法7.鞭毛染色法（1）硝酸银染色法⑤染色涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。若加B液后显色较慢，可用微