DB32-T 3115-2016菊花脱毒种苗生产技术规程

ICS65.020.20

B05

备案号：51460-2016DB32

江苏省地方标准

DB32/T3115-2016

菊花脱毒种苗生产技术规程

Technologyofvirus-freechrysanthemumstockproduce

2016-09-20发布2016-11-20实施

江苏省质量技术监督局发布

DB32/T3115-2016

前言

本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》组织编制。

本标准由南京农业大学提出并归口。

本标准起草单位：南京农业大学。

本标准主要起草人：陈素梅、管志勇、吴丹、张飞、房伟民、蒋甲福、陈发棣。

II

DB32/T3115-2016

菊花脱毒种苗生产技术规程

1范围

本标准规定了菊花脱毒种苗生产技术要求和规程.

本标准适用于常见菊花脱毒种苗的生产。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版

本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。

NY/T1591-2008菊花切花种苗等级规格

DB32/T1530-2009切花菊种苗生产技术规程

3待脱毒材料

凡有待进行脱毒处理的品种均应是通过合法途径引进的，签署有关品种权保护协议，或者经自主选

育的、具有知识产权的品种。

4脱毒处理

4.1茎尖培养脱毒

4.1.1无菌苗再生体系的建立

经检测含有特定病毒的菊花，取其越冬脚芽，进行外植体表面灭菌，具体步骤如下：剪除茎段上的

叶片，用流动的蒸馏水冲洗15分钟后，用滤纸吸干后，于超净工作台上用75%酒精浸泡30s，再转移到0.1%

升汞中洗涤3～5min，取出，用无菌水冲洗5～6次，每次不少于3min，经消毒灭菌后的菊花茎段剪成小

段，每段长2-3cm，带有1～2腋芽，接种于MS培养基中，每个组培瓶1～2个茎段。

4.1.2剥取茎尖

在超净工作台上操作，于解剖镜下，将材料置于消毒的滤纸上，用经消毒的手术刀和解剖针逐步剥

去外层叶片，切取0.5～1.0mm直径大小的带有1～2片叶原基的茎尖顶端组织。

4.1.3分化培养

将剥取的茎尖接种于经过高温湿热灭菌的分化培养基上，并对接种的茎尖分别编号，置于25℃、

光照强度1500～3000lx、光照时间16h/天的条件下培养，2～3个月后可分化出新芽。

1

DB32/T3115-2016

4.1.4诱导生根

切取1～2cm分化出的新芽接入生根培养基中，在25℃和光照强度1500～3000lx条件下，培养15～

20d可长出新根。对每株生根苗进行编号。

4.2热处理结合茎尖培养脱毒

4.2.1热处理方法

将待脱毒的菊花植株放入光照培养箱中，采用变温升温的方式进行热处理，在日温/夜温分别为

26℃/20℃下培养2d，而后每两天昼/夜温度分别升高2℃，直至38℃/30℃，该温度下培养40d。光照

时间16h/天，光强为2000lx。剥取热处理过程长出的新梢顶端0.3～0.5mm的茎尖进行组织培养。

4.2.2热处理茎尖培养脱毒

按照4.1茎尖培养脱毒方法进行培养，分化出苗、转接生根，对每株生根苗进行编号。

5病毒检测

5.1主要病毒种类

菊花B病毒ChrysanthemumvirusB（CVB)

番茄不孕病毒Tomatoaspermyvirus（TAV)

番茄斑萎病毒Tomatospottedwiltvirus（TSWV)

黄瓜花叶病毒Cucumbermosaiccucumovirus（CMV)

菊花矮化类病毒Chrysanthemumstuntviroid（CSVd)

菊花萎黄斑驳类病毒Chrysanthemumchloroticmottleviroid(CChmvd)。

5.2检测病毒，见附录A。

取2～3cm高的植株叶片组织作为检测样品，确认不带病毒的材料为脱毒原种苗，用于进一步繁殖。

6脱毒原种苗的保存、扩繁与炼苗移栽

6.1脱毒原种苗保存

将脱毒原种试管苗转接到MS琼脂培养基上，置于20～25℃的光照培养室中保存，20～30d继代转

接一次，继代次数控制在10～15代。

6.2脱毒原种苗的扩繁

2

DB32/T3115-2016

调节增殖培养基中细胞分裂素和生长素浓度的比例，使增殖比控制在2.5～3.5倍之间。切取增殖

后的组培不定芽，转接至生根培养基中进行生根培养。

6.3脱毒原种苗的炼苗移栽

瓶苗株高6～7cm，5～6平展片，具5条以上3～4cm长的根时即可炼苗。炼苗以泥炭：珍珠岩（1:1,

V/V）为基质，铺于苗床或穴盘内。将组培生根苗至于光亮处锻炼2～3天，将其从组培瓶中取出，洗去

根部附着的培养基，然后种植于上述苗床或穴盘内，20～30天后，每周浇1/4至1/8浓度的MS营养液

以促进生长。温度控制在15～25℃。

7脱毒原种苗的生物性状观察

随机抽取每个无性系脱毒苗5～10株，与其母株一并种植至开花。观察比较其主要生物性状，与母

株无差异者则可确认为原种苗，有差异则淘汰整个无性系。

8脱毒原种苗的繁殖

8.1组织培养繁殖

按照3.4.2脱毒苗扩繁的方法进行。

8.2扦插繁殖

参照DB32/T1530-2009中的7、8、9执行。

9建立脱毒苗母本圃

保护地栽培，在防虫温室内作苗床栽培或地栽。土壤或基质须经蒸汽或药剂消毒，定植前施颗粒有

机肥（1kg/m2），pH值6～7，电导率0.8～1.2。

10脱毒种苗的质量检测

脱毒种苗的质量检测参照NY/T1591-2008中5.1.3进行抽样检查，并按照NY/T1591-2008中5.2

的内容进行检测，确定种苗的质量等级。

11包装与贮运

11.1包装

种苗袋选用材质为0.05～0.08mm的透明塑料薄膜，大小为35cm×35cm，袋上打12～16个直径5mm

的透气孔。每袋装种苗50～100株，袋装时须将带基质的根部朝下，茎叶部朝上，整齐排列，然后装入

专用种苗箱。包装箱材质应为双瓦楞纸箱，种苗箱应有良好的承载能力和耐湿性，宽40cm，长60cm，

3

DB32/T3115-2016

高20cm～22cm，两侧留有透气孔。装箱时种苗袋应直立排放，每箱放置500～1000株。装箱后用胶带

封好箱口。

11.2包装标识

包装箱(图1)上应有明显标识，内容包括：产品名称、质量等级、包装容量、生产单位、产地、采

收包装日期，若需冷藏保存，应注明冷藏温度。标识内容要求字迹清晰、完整、规范。

图1种苗包装箱

11.3贮运

可在2～5℃冷库中贮存，贮存时间不超过7d。种苗运输时间超过3d时，则应采用控温4～6℃的

冷藏车。

4

DB32/T3115-2016

AA

附录A

（规范性附录）

RNA病毒的反转录——聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法

A.1设备和材料

枪头、离心管和PCR管均需经高温消毒。

A.1.1微量移液器：200~1000μL、20~200μL、10~100μL、0.5~10μL、0.5~2.5μL、0~1.0μL。

A.1.2电子天平：精度为0.01g。

A.1.3高速冷冻离心机。

A.1.4PCR仪。

A.1.5水平凝胶电泳系统。

A.1.6凝胶成像系统。

A.2药品和试剂

所用试剂为分析纯，水为灭菌的双蒸水。

A.2.1RNA提取试剂

Trizol，氯仿，异丙醇，70%乙醇，DEPC水，双蒸水。

A.2.2反转录试剂

M-MLV反转录酶，5×M-MLV缓冲液，核糖核酸酶抑制剂，随机引物，10mmol/LdNTP。-20℃贮藏。

A.2.3PCR试剂

TaqDNA聚合酶，10×Buffer，PCR引物（上游，下游）。

A.2.45×TBE缓冲液

A.2.5加样缓冲液

0.25%溴酚蓝溶解于40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃保存。

A.3操作步骤

A.3.1菊花总RNA的提取

菊花总RNA的提取按照TaKaRa公司提供的Trizol试剂盒说明书进行，具体步骤包括：

(1)取菊花叶片l00mg，用液氮研磨，加入1mL的RNA提取液，混合均匀，于冰上静置5min。

(2)4℃，12000g高速离心10min，吸取上层溶液转移到新的1.5mL的EP离心管中。

(3)向离心管中加入1/5体积的氯仿溶液，振荡，混合均匀，于室温下静置5min。

(4)4℃，12000g高速离心15min，吸取上层溶液转移到新的1.5mLEP离心管中。

(5)重复步骤(3)、(4)两次。

5

DB32/T3115-2016

(6)向1.5mLEP管中加入等体积的异丙醇(预冷)，摇匀，室温下静置10min。

(7)4℃，12000g高速离心l0min，弃上清。

(8)用1mL75%的乙醇洗涤2~3次，12000g高速离心10min，弃上清，于超净工作台上通风干燥

RNA，并加入30μL的无RNase的DEPC水溶解。

(9)取2μL的RNA加58μL的DEPC水稀释，用核酸定量仪在260/280nm测量RNA的浓度及纯度。

(10)取2μL的RNA溶液，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，其余的RNA放置于-80℃

保存备用。

A.3.2第一链cDNA合成

cDNA合成参照试剂盒(M-MLVRTasecDNASynthesisKit,TaKaRa)，具体步骤如下：

(1)在离心管中配制下列混合液:

TotalRNA(10pg-5μg)1μL

RadomPrimer(25μM)1μL

RNaseFreedH2O4μL

(2)-70℃保温10min后，迅速在冰上放置2min以上。

(3)离心数秒，使模板RNA/引物变性溶液聚集于离心管底部。

(4)在上述Microtube管中配置下列反转录反应液：

上述模板RNA/引物变性溶液6μL

5×M-MLVBuffer2μL

dNTPsMixture(10mMeach)0.5μL

RNaseInhibitor(40U/nl)0.25μL

RTaseM-MLV(RHaseH-)(200U/μL)0.4μL

RNaseFreedH2O0.85μL

(5)30℃保温10min。

(6)42℃延伸1h。

(7)70℃保温15min后冰上冷却，得到的cDNA直接用于PCR扩增，也可置于-20℃保存。

A.3.3PCR扩增及电泳

(1)在Microtube管中配制下列混合液:

10×PCRBuffer2.5μL

Mg2+1.5μL

dNTP(2.5mMeach)2.0μL

上游引物(20μM)1.0μL

下游引物(20μM)1.0μL

cDNA1.0μL

rTaq(5U/μL)0.2μL

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DB32/T3115-2016

ddH2Oaddto25μL

(2)PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，按照不同病毒退火温度不同，72℃延伸1min，

35个循环；72℃延伸7min；4℃保温。

(3)电泳：配制1%-1.75%(W/V)的琼脂糖凝胶；放入电泳槽中，电泳液浸没胶面1mm。样品中加

入等体积的上样缓冲液，混匀；沿着胶孔边缘匀速加入。接通电源，选择合适的电压和时间电泳。电泳

结束后，胶块置于紫外成像系统中，调整拍摄范围和焦距，拍摄成像。

A.4结果判断

阳性对照有目标带出现，阴性对照无带时，检测的效果为有效。检测样品有与阳性对照相同的目标

带出现时为阳性，无目标带为阴性。

表1菊花病毒的特异性引物

病毒名称引物序列（5’-3’）退火温度产物（bp）

菊花B病毒P1：ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC55℃650

（CVB）P2：TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT

番茄不孕病毒P1：CCATCCCTTCAACATCCGACTT52℃499

（TAV）P2：GGAGCGTTGAAGCGGAAGGAAT

番茄斑萎病毒P1：CTCTGGTGTCATACTTCTTTGGG58℃264

（TSWV）P2：GGCTTGTAGAGGAAACTGGGAAT

黄瓜花叶病毒P1：GTAGTGAACGATGTAAACCTGGG59℃210

（CMV）P2：GCAGGAACTTTACGAACTGTCAC

菊花萎黄斑驳类病毒P1：CAGTTTCGGCTTGTGCGGGAGT53℃217

（CChMVd）P2：TCCGAGGAGAATATCCAACGAG

菊花矮化类病毒P1：ACTCCTGACCCTGCTGCTT50℃313

（CSVd）P2：AAGGTTCCACGGGCTTACT

_________________________________

7

DB32/T3115-2016

目次

前言................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3待脱毒材料.........................................................................1

4脱毒处理...........................................................................1

5病毒检测...........................................................................2

6脱毒原种苗的保存、扩繁与炼苗移栽...................................................2

7脱毒原种苗的生物性状观察...........................................................3

8脱毒原种苗的繁殖...................................................................3

9建立脱毒苗母本圃...................................................................3

10脱毒种苗的质量检测................................................................3

11包装与贮运........................................................................3

附录A（规范性附录）RNA病毒的反转录——聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法...........5

I

DB32/T3115-2016

菊花脱毒种苗生产技术规程

1范围

本标准规定了菊花脱毒种苗生产技术要求和规程.

本标准适用于常见菊花脱毒种苗的生产。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版

本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。

NY/T1591-2008菊花切花种苗等级规格

DB32/T1530-2009切花菊种苗生产技术规程

3待脱毒材料

凡有待进行脱毒处理的品种均应是通过合法途径引进的，签署有关品种权保护协议，或者经自主选

育的、具有知识产权的品种。

4脱毒处理

4.1茎尖培养脱毒

4.1.1无菌苗再生体系的建立

经检测含有特定病毒的菊花，取其越冬脚芽，进行外植体表面灭菌，具体步骤如下：剪除茎段上的

叶片，用流动的蒸馏水冲洗15分钟后，用滤纸吸干后，于超净工作台上用75%酒精浸泡30s，再转移到0.1%

升汞中洗涤3～5min，取出，用无菌水冲洗5～6次，每次不少于3min，经消毒灭菌后的菊花茎段剪成小

段，每段长2-3cm，带有1～2腋芽，接种于MS培养基中，每个组培瓶1～2个茎段。

4.1.2剥取茎尖

在超净工作台上操作，于解剖镜下，将材料置于消毒的滤纸上，用经消毒的手术刀和解剖针逐步剥

去外层叶片，切取0.5～1.0mm直径大小的带有1～2片叶原基的茎尖顶端组织。

4.1.3分化培养

将剥取的茎尖接种于经过高温湿热灭菌的分化培养基上，并对接种的茎尖分别编号，置于25℃、

光照强度1500～3000lx、光照时间16h/天的条件下培养，2～3个月后可分化出新芽。

1

DB32/T3115-2016

4.1.4诱导生根

切取1～2cm分化出的新芽接入生根培养基中，在25℃和光照强度1500～3000lx条件下，培养15～

20d可长出新根。对每株生根苗进行编号。

4.2热处理结合茎尖培养脱毒

4.2.1热处理方法

将待脱毒的菊花植株放入光照培养箱中，采用变温升温的方式进行热处理，在日温/夜温分别为

26℃/20℃下培养2d，而后每两天昼/夜温度分别升高2℃，直至38℃/30℃，该温度下培养40d。光照

时间16h/天，光强为2000lx。剥取热处理过程长出的新梢顶端0.3～0.5mm的茎尖进行组织培养。

4.2.2热处理茎尖培养脱毒

按照4.1茎尖培养脱毒方法进行培养，分化出苗、转接生根，对每株生根苗进行编号。

5病毒检测

5.1主要病毒种类

菊花B病毒ChrysanthemumvirusB（CVB)

番茄不孕病毒Tomatoaspermyvirus（TAV)

番茄斑萎病毒Tomatospottedwiltvirus（TSWV)

黄瓜花叶病毒Cucumbermosaiccucumovirus（CMV)

菊花矮化类病毒Chrysanthemumstuntviroid（CSVd)

菊花萎黄斑驳类病毒Chrysanthemumchloroticmottleviroid(CChmvd)。

5.2检测病毒，见附录A。

取2～3cm高的植株叶片组织作为检测样品，确认不带病毒的材料为脱毒原种苗，用于进一步繁殖。

6脱毒原种苗的保存、扩繁与炼苗移栽

6.1脱毒原种苗保存

将脱毒原种试管苗转接到MS琼脂培养基上，置于20～25℃的光照培养室中保存，20～30d继代转

接一次，继代次数控制在10～15代。

6.2脱毒原种苗的扩繁

2

DB32/T3115-2016

调节增殖培养基中细胞分裂素和生长素浓度的比例，使增殖比控制在2.5～3.5倍之间。切取增殖

后的组培不定芽，转接至生根培养基中进行生根培养。

6.3脱毒原种苗的炼苗移栽

瓶苗株高6～7cm，5～6平展片，具5条以上3～4cm长的根时即可炼苗。炼苗以泥炭：珍珠岩（1:1,

V/V）为基质，铺于苗床或穴盘内。将组培生根苗至于光亮处锻炼2～3天，将其从组培瓶中取出，洗去

根部附着的培养基，然后种植于上述苗床或穴盘内，20～30天后，每周浇1/4至1/8浓度的MS营养液

以促进生长。温度控制在15～25℃。

7脱毒原种苗的生物性状观察

随机抽取每个无性系脱毒苗5～10株，与其母株一并种植至开花。观察比较其主要生物性状，与母

株无差异者则可确认为原种苗，有差异则淘汰整个无性系。

8脱毒原种苗的繁殖

8.1组织培养繁殖

按照3.4.2脱毒苗扩繁的方法进行。

8.2扦插繁殖

参照DB32/T1530-2009中的7、8、9执行。

9建立脱毒苗母本圃

保护地栽培，在防虫温室内作苗床栽培或地栽。土壤或基质须经蒸汽或药剂消毒，定植前施颗粒有

机肥（1kg/m2），pH值6～7，电导率0.8～1.2。

10脱毒种苗的质量检测

脱毒种苗的质量检测参照NY/T1591-2008中5.1.3进行抽样检查，并按照NY/T1591-2008中5.2

的内容进行检测，确定种苗的质量等级。

11包装与贮运

11.1包装

种苗袋选用材质为0.05～0.08mm的透明塑料薄膜，大小为35cm×35cm，袋上打12～16个直径5mm

的透气孔。每袋装种苗50～100株，袋装时须将带基质的根部朝下，茎叶部朝上，整齐排列，然后装入

专用种苗箱。包装箱材质应为双瓦楞纸箱，种苗箱应有良好的承载能力和耐湿性，宽40cm，长60cm，

3

DB32/T3115-2016

高20cm～22cm，两侧留有透气孔。装箱时种苗袋应直立排放，每箱放置500～1000株。装箱后用胶带

封好箱口。

11.2包装标识

包装箱(图1)上应有明显标识，内容包括：产品名称、质量等级、包装容量、生产单位、产地、采

收包装日期，若需冷藏保存，应注明冷藏温度。标识内容要求字迹清晰、完整、规范。

图1种苗包装箱

11.3贮运

可在2～5℃冷库中贮存，贮存时间不超过7d。种苗运输时间超过3d时，则应采用控温4～6℃的

冷藏车。

4

DB32/T3115-2016

AA

附录A

（规范性附录）

RNA病毒的反转录——聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法

A.1设备和材料

枪头、离心管和PCR管均需经高温消毒。

A.1.1微量移液器：200~1000μL、20~200μL、10~100μL、0.5~10μL、0.5~2.5μL、0~1.0μL。

A.1.2电子天平：精度为0.01g。

A.1.3高速冷冻离心机。

A.1.4PCR仪。

A.1.5水平凝胶电泳系统。

A.1.6凝胶成像系统。

A.2药品和试剂

所用试剂为分析纯，水为灭菌的双蒸水。

A.2.1RNA提取试剂

Trizol，氯仿，异丙醇，70%乙醇，DEPC水，双蒸水。

A.2.2反转录试剂

M-MLV反转录酶，5×M-MLV缓冲液，核糖核酸酶抑制剂，随机引物，10mmol/LdNTP。-20℃贮藏。

A.2.3PCR试剂

TaqDNA聚合酶，10×Buffer，PCR引物（上游，下游）。

A.2.45×TBE缓冲液

A.2.5加样缓冲液

0.25%溴酚蓝溶解于40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃保存。

A.3操作步骤

A.3.1菊花总RNA的提取

菊花总RNA的提取按照TaKaRa公司提供的Trizol试剂盒说明书进行，具体步骤包括：

(1)取菊花叶片l00mg，用液氮研磨，加入1mL的RNA提取液，混合均匀，于冰上静置5min。

(2)4℃，12000g高速离心10min，吸取上层溶液转移到新的1.5mL的EP离心管中。

(3)向离心管中加入1/5体积的氯仿溶液，振荡，混合均匀，于室温下静置5min。

(4)4℃，12000g高速离心15min，吸取上层溶液转移到新的1.5mLEP离心管中。

(5)重复步骤(3)、(4)两次