生物（人教版选修3）课件1.1DNA重组技术的基本工具

专题一基因工程1．1

DNA重组技术的基本工具1．认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。2．简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。3．简述基因工程中载体需要具备的条件。一、基因工程的概念基因工程的别名

技术操作环境生物体外操作对象操作水平基本过程剪切→

→

→表达结果人类需要的新的

和________DNA重组基因DNA分子水平拼接导入生物类型生物产品1．从DNA结构及配对方式的角度分析，为什么不同生物的DNA能够重组？提示：(1)基本结构相同。(2)空间结构相同。(3)碱基配对方式相同。二、DNA重组技术的基本工具1．限制性核酸内切酶(也称“限制酶”)(1)来源：主要来自于

。(2)种类：约

种。(3)特点：具有专一性。表现在两个方面：①识别双链DNA的某种

序列。②切割特定核苷酸序列中的特定位点。(4)作用：断裂

的两个核苷酸之间的

。(5)结果：产生黏性末端或

。原核生物4000特定核苷酸特定部位磷酸二酯键平末端2．DNA连接酶——“分子缝合针”(2)作用：形成

。(3)结果：形成重组DNA分子。磷酸二酯键3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)作用：携带

片段进入受体细胞。(2)种类：

、

的衍生物、动植物病毒等。(3)特点：①能够在受体细胞中进行

或整合到

上，随染色体DNA进行

。②有

限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入。③具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。外源基因质粒λ噬菌体自我复制染色体DNA一个至多个2．为什么在使用限制酶时，每种酶的切割位点最好只有一个？提示：若用于切割载体的限制酶有多个切割位点，则切割后质粒可能会丢失某些片段，若丢失的片段含有复制原点，则重组DNA分子进入受体后便不能进行自主复制。一、几种工具酶的作用比较1．限制性核酸内切酶与DNA连接酶的比较(1)区别：作用应用限制性核酸内切酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于基因表达载体的构建(2)两者的关系可表示为：2．限制性核酸内切酶与解旋酶的比较(1)相同点：都是作用于DNA分子中的化学键。(2)不同点：作用部位不同，前者作用于磷酸二酯键，后者作用于氢键。3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶相同点催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键不同点模板不需要模板需要DNA的一条链为模板作用对象游离的DNA片段单个的脱氧核苷酸作用结果形成完整的DNA分子形成DNA的一条链用途基因工程DNA复制4.四种酶的作用部位图解(1)作用于a(磷酸二酯键)的酶有：限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶。(2)作用于b(氢键)的酶有解旋酶。【特别提醒】(1)限制性核酸内切酶是一类酶而不是一种酶。(2)限制性核酸内切酶作用的化学键为磷酸二酯键，而不是氢键。(3)DNA连接酶无识别的特异性，凡两个黏性末端(或平末端)能互补配对，DNA连接酶就能催化其“缝合”，重新形成DNA分子。(4)氢键的形成不需要DNA连接酶。

下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制酶BamHⅠHind

ⅢEcoRⅠSma

Ⅰ识别序列及切割位点↓

GGATCCCCTAGG

↑↓

AAGCTTTTCGAA

↑↓

GAATTCCTTAAG

↑↓CCCGGGGGGCCC↑(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有______个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越______。(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma

Ⅰ切割，原因是___________________________________。(4)与只使用EcoRI相比较，使用BamHⅠ和Hind

Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止________________________________________________。(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入______酶。(6)现使用BamHⅠ和Hind

Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA，并经拼接获得的重组质粒进行再次酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1、2中标示的酶切位点及表中所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断：①采用BamHⅠ和Hind

Ⅲ酶切，得到______种DNA片段。②采用EcoRⅠ和Hind

Ⅲ酶切，得到______种DNA片段。解析：(1)该质粒为环状DNA，经SmaⅠ切割前，不含有游离的磷酸基团，经SmaⅠ切割后形成平末端，含有2个游离的磷酸基团。(2)SmaⅠ识别的是CCCGGG序列，在C与G之间切割，SmaⅠ酶切位点越多，也就是C－G碱基对越多，C与G之间的氢键(3个)比A与T之间的氢键(2个)数量多，其含量越多，质粒的热稳定性越高。(3)据图1可知，SmaⅠ切割位点在抗生素抗性基因(标记基因)中，据图2可知，SmaⅠ切割位点在目的基因中，因此使用SmaⅠ切割会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因。(4)用同一种限制酶处理质粒和外源DNA，再用DNA连接酶连接时，往往会有三种连接形式：目的基因—质粒、目的基因—目的基因(环化)、质粒—质粒(环化)，后两种是我们不需要的，因而要进行筛选。用两种限制酶处理质粒和外源DNA，因形成的末端不同可避免上述情况的发生。(5)连接质粒与目的基因的工具酶是DNA连接酶。(6)分析由BamHⅠ和Hind

Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA，并经拼接获得的重组质粒，这两种酶的识别序列仍然完整存在，如再用BamHⅠ和Hind

Ⅲ两种限制酶进行酶切时，可再度被切开，形成2种DNA片段；而EcoRⅠ的识别序列在原质粒中存在并没有破坏，同时切下的目的基因中还存在1个EcoRⅠ的识别序列，因此在重组质粒中存在2个EcoRⅠ的识别序列，如用EcoRⅠ和Hind

Ⅲ酶切，可得到3种DNA片段。答案：(1)0、2

(2)高(3)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因(4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化(5)DNA连接(6)①2

②3【归纳拓展】(1)限制酶切割形成黏性末端的几种类型：①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同。②同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。③不同限制酶切割不同DNA分子形成相同黏性末端，如互补则可以相互重新配对。(2)切割质粒时，标记基因不能全部被破坏。1．下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是(

)A．①②③④

B．①②④③C．①④②③ D．①④③②解析：本题考查不同工具酶的作用及作用特点。图示中①表示该酶切割DNA分子双链产生黏性末端的过程，用到的酶是限制性核酸内切酶，②是黏性末端连接的过程，用到的酶是DNA连接酶，③是DNA分子解旋的过程，要用解旋酶，④是DNA复制时子链的形成过程，需要DNA聚合酶。答案：C二、基因工程中常用的载体——质粒1．种类(1)常用载体：质粒，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。(2)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。3．作用(1)用它作为运输工具，将目的基因送入受体细胞中去。(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。【特别提醒】一般来说，天然载体往往不能满足上述要求，因此要根据不同的目的和需要，对载体进行人工改造，现在所使用的质粒几乎都是经过改造的。

质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，下表是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是A．①是c；②是b；③是aB．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是aD．①是c；②是a；③是b细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况细菌在含四环素的培养基上的生长状况①能生长能生长②能生长不能生长③不能生长能生长解析：对①细菌来说，能在含氨苄青霉素的培养基上生长，也能在含四环素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因都没有被破坏，插入点是c；对②细菌来说，能在含氨苄青霉素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因正常，不能在含四环素的培养基上生长，说明其抗四环素基因被破坏，插入点应为b；对③细菌来说，不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因被插入而破坏，故插入点为a。答案：A【名师点睛】基因工程所用载体与细胞膜上载体的比较(1)化学本质不同：作为基因运输工具的载体其化学本质是DNA或动植物病毒或λ噬菌体的衍生物，而细胞膜上的载体的化学本质是蛋白质。(2)作用不同：基因工程所用载体是将目的基因导入受体细胞中；细胞膜上的载体是离子或某些小分子进出细胞的运输工具。2．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件及理由是(

)A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件D．能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选解析：作为载体要携带目的基因进入受体细胞并使之表达；必须能够在宿主细胞中稳定地保存并大量复制，以便通过复制提供大量目的基因；同时要具有标记基因，是为了通过标记基因是否表达来判断目的基因是否进入了受体细胞，便于筛选。载体要具有多个限制酶切点，为了便于与外源基因连接。答案：A一、寻根问底1．根据你所掌握的知识，你能推测这类酶存在于原核生物中的作用是什么吗？(教材P4)提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原体的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA入侵时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，从而达到保护自身的目的。2．DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？(教材P6)提示：不是一回事。(1)DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；