第八章-发酵过程参数的检测及控制

第八章

发酵过程的监测与控制

发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛。按性质分物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等一、发酵过程检测的主要参数从检测手段分直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等①在线检测参数：不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；②离线检测参数：取出样后测定得到的参数，如残糖、

NH2-N、菌体浓度。间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等二、发酵过程参数常用检测方法及仪器主要参数检测原理及仪器取样系统生物反应过程大多为纯培养，无菌操作十分重要。问题三角瓶内的培养液如何取样？发酵罐常用取样方式可否知道？蒸汽连续在线无菌取样微孔陶瓷管渗透膜管发酵清液不能取菌体挥发性物质检测问题：检测所得产物浓度为发酵液中产物浓度吗？主要参数检测原理及仪器温度的测定一般出厂就已经校正好。热电阻、热电偶、半导体热敏电阻、玻璃温度计主要参数检测原理及仪器罐压的测定问题：为什么连接管为直管而不是弯管以保护压力表？隔膜式压力表液面或泡沫上升与电极探针接触产生电信号。主要参数检测原理及仪器液位和泡沫高度的检测主要参数检测原理及仪器液体和气体流量测定主要参数检测原理及仪器搅拌转速常用检测方法：磁感应式、光感应式和测速发电机等。感应片切割磁场或光速。输出电压与转速成正比。主要参数检测原理及仪器

pH的检测常用pH检定仪为复合pH电极，具有结构紧凑，可蒸汽加热灭菌的优点。思考：pH电极如何标定？1、常用检测方法：溶氧电极法主要参数检测原理及仪器溶氧的检测思考：溶氧电极如何标定？2、电极的标定一般测定中应进行以下二点标定（1）零点标定用饱和Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降稳定后，调节零点旋钮显示零值。

（2）饱和校正（满刻度）

进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至100%即为饱和值。主要参数检测原理及仪器生物量的测定

干（湿）重法压缩体积法（离心）光密度测定法OD600~660

其它方法（测粘度、静置沉降体积法）问题：请问以上几种方法的适用范围？主要参数检测原理及仪器产物量的测定

比色法利用HPLC检测生物法（杯碟法）……斐林试剂法DNS法苯酚硫酸法主要参数检测原理及仪器糖的测定凯氏定氮法格利氏法

氨氮的测定生物发酵溶液中营养成分与产物的分析类别检测物质发酵液待检测的物质成分微生物细胞营养基质葡萄糖、麦芽糖、乳糖、醋酸、BOD等产物及副产物乙醇、氨、蛋白质、抗生素、氨基酸、有机酸、酶、CH4、氢等营养盐生长因子无机盐(K+、Ca2+、NH+、NO3-等)、生物素、维生素动物细胞营养基质葡萄糖、氨基酸等产物及副产物蛋白质类（t-PA、GCSF、EPO、INF等)、乳酸、氨生长因子维生素、激素、抗生素植物细胞营养基质糖类、醋酸、硝酸盐、氨基酸等产物及副产物次生代谢产物（植物色素、皂甙等）、氨、CO2生长素维生素、植物激素（2,4-D、NAA、6-BA等）生物传感器

(Biosensor)

传感器：能感受(或响应)一种信息并变换成可测量信号(一般指电学量)的器件。

生物传感器：将生物体的成份（酶、抗原、抗体、激素）或生物体本身（细胞、细胞器、组织）固定化在一器件上作为敏感元件的传感器称为生物传感器。生物传感器的基本组成组成：敏感元件（分子识别元件）和信号转换器件生物传感器的分类思考题以上参数哪些是物理参数？哪些是化学参数？哪些是生物参数？以上参数哪些是直接参数？哪些是间接参数？以上参数哪些是在线检测参数？哪些是离线检测参数？发酵工业中哪些参数的测定频率最高？三、发酵过程的控制主要控制温度、pH、溶氧浓度、基质浓度、泡沫等。发酵过程的自动控制

变量测量和变化规律的认识→控制器(自动化仪表、计算机组成)→控制关键变量→控制发酵过程1、基本的自动控制系统①前馈控制②反馈控制③自适应控制2、发酵自动控制系统的硬件组成1、基本的自动控制系统①前馈控制：通过动态反应快的变量测量来预测反应慢、易干扰的被控对象的变化，并提前实施控制。如：通过冷却水压力（控制阀）控制温度变化。1、基本的自动控制系统②反馈控制反馈控制是自动控制的主要方式控制器被控对象传感器1、基本的自动控制系统②反馈控制开关控制：控制阀门的全开全关；

PID控制：采用比例、积分、微分控制算法；串联反馈控制：两个以上控制器对一变量实施联合控制；前馈/反馈控制：前馈控制与反馈控制相结合。1、基本的自动控制系统③自适应控制：提取有关输入、输出信息，对模型和参数不断进行辩识，使模型逐渐完善；同时自动修改控制器的动作，适应实际过程。——自适应控制系统。2、发酵自动控制系统的硬件组成传感器变送器执行机构电磁阀、气动控制阀、电动调节阀、变速电机、正位移泵、蠕动泵。转换器过程接口监控计算机（一）温度的控制控温方式：简单的On-Off（通-断）控制或PID控制。生产罐：冷、热水间接冷却或加热（过夹套或盘管）。问题：一般10m3以下发酵罐用夹套，10m3以上用盘管，为什么？（二）pH的控制一般PID控制碳、氮源影响pH值pH下降——加碱（常用氨水）pH上升——需要对培养基进行调整1、发酵过程中pH的变化生长阶段生成阶段自溶阶段碳源过量消泡油添加过量生理酸性物质的存在2、引起pH下降的因素氮源过多生理碱性物质的存在中间补料，碱性物质添加过多3、引起pH上升的因素调节基础培养基的配方调节碳氮比（C/N）添加缓冲剂补料控制直接加酸加碱补加碳源或氮源4、pH的控制（三）溶氧控制通气量搅拌速度培养基组成补料方式及速率富氧空气反应器型式罐压……（四）泡沫控制通气与搅拌培养基组成培养液性质变化灭菌染菌……1、影响泡沫稳定的因素2、泡沫控制的方法化学消泡——天然油脂、泡敌等。机械消泡罐内罐外其他方法调节通风与搅拌、增大罐压、……（五）补料控制1、基质浓度对发酵的影响抑制生长饥饿根据经验控制；以pH、尾气、溶氧、产物浓度等参数间接控制流加；用传感器直接测定限制性基质的浓度，直接控制流加；……2、补料控制的策略！！！！R：各控制参数

pHDO

预设补料速率

……四、发酵染菌的危害与防止所谓“杂菌”，是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。（一）发酵过程中染菌的检查判断１、生产上常用杂菌检查方法镜检（简便快速，早期染菌不易检出)平板划线酚红肉汤培养2、辅助检查方法溶解氧pH值尾气中CO2含量能检出更少杂菌，结果更准确需时较长，操作较繁琐发酵染菌的主要原因仪器设备的渗漏仪器、设备、管道、管件存在死角操作不当预防为主，“防重于治”（二）发酵过程染菌原因的分析（１）国外一抗生素发酵染菌原因的分析染菌原因百分率，%染菌原因百分率，%种子带菌9.64蛇管穿孔5.89接种时罐压跌零0.19接种管穿孔0.39培养基灭菌不透0.79阀门泄漏1.45空气系统带菌19.96罐盖漏1.54搅拌轴密封泄漏2.09其他设备漏10.13泡沫冒顶0.48操作问题10.15夹套穿孔12.36原因不明24.91（２）国内一制药厂发酵染菌原因的分析染菌原因百分率，%外界带入杂菌（取样、补料带入）8.20设备穿孔7.60空气系统带菌26.00停电罐压跌零1.60接种11.00蒸汽压力不够或蒸汽量不足0.60管理问题7.09操作违反规程1.60种子带菌0.60原因不明35.00大批发酵罐染菌→空气系统部分发酵罐(或罐组)染菌前期→种子带杂菌，或灭菌不彻底中后期→中间补料系统或管路系统发生问题个别发酵罐连续染菌设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)设备的腐蚀磨损（出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象）个别发酵罐偶然染菌→原因比较复杂（３）从染菌的规模来分析染菌原因？分析分析发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理（４）从染菌的时间来分析耐热性芽抱杆菌：死角或灭菌不彻底球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌)：发酵罐的冷却管或夹套渗漏霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格（５）从染菌的类型来分析１.种子带菌的原因及防止带菌的原因无菌室的无菌条件不符合要求、培养基灭菌不彻底、操作不当。种子带菌的防止保持卫生规范操作（三）发酵染菌的防止２.发酵设备、管件的渗漏