第三讲层析技术

第三讲层析技术主要内容一、层析分离的基本概念二、层析分离的分类三、层析分离的基本原理四、层析过程和仪器设备五、具体应用一、层析分离的基本概念及其特点层析分离技术早在二十世纪初就已在生产实践中使用。1903年，俄国植物学家茨维特(Tswett)在研究植物叶子的组成时，用碳酸钙作吸附剂，用石油醚作为洗脱剂，他把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒入管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内形成了数条相互分离的色带，当时茨维特把这种色带叫作“色谱”（Chromatographie）。在这一方法中把玻璃管称为“色谱柱”，碳酸钙称为“固定相”，纯净的石油醚称为“流动相”。因此，层析分离又称色谱分离（ChromatographicResolution,CR）或色层分离，本讲统一使用层析分离这一名称。1.基本概念一、层析分离的基本概念及其特点层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分混合物中各组分的物理化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两个相（固定相和流动相）中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差异，在固定相和流动相之间经过多次分配（吸附-解吸-再吸附-再解吸……）以不同的速率移动，从而达到分离的目的。1.基本概念二、层析分离的分类1.按分离机理不同分类吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析2.按固定相形状不同分类柱层析层析、纸层析层析、薄层层析层析3.根据流动相的物理形态不同分类气相层析、液相层析、超临界流体层析4.根据操作压力不同分类低压层析分离（<0.5MPa）中压层析分离（0.5~5MPa）高压层析分离（5~50MPa）三、层析分离的基本原理（一）吸附层析（二）分配层析（三）凝胶过滤层析三、层析分离的基本原理

（一）吸附层析原理：混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物得到分离。吸附剂：氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙等。特点：应用最早，价格较低；选择性低。新型吸附层析技术：离子交换层析、亲和层析、金属鳌合层析、疏水作用层析等。1.简介离子交换层析利用离子交换剂作为层析支持物（固定相），由于带有不同电荷的蛋白质与固定相间的静电作用力（吸附力）不同，从而达到分离目。基本原理载体官能团可交换离子离子交换层析离子交换剂主要由三部分组成——载体、官能团及可交换离子。离子交换剂的种类载体官能团可交换离子离子交换剂

按可交换离子带电性不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。按官能团不同，可分为强/弱酸性离子交换剂（阳）和强/弱碱性离子交换剂（阴）。

常用的载体基质有：纤维素、葡聚糖、琼脂糖及玻璃珠等。。

（强酸性阳离子）（弱酸性阳离子）（强碱性阴离子）（强碱性阴离子）（弱碱性阴离子）亲和层析基本原理：利用了生物物质间的特异性相互作用，或者说是利用了某些生物物质之间特异的亲和力进行选择性分离的一种层析分离技术。目标物亲和层析的基本组成：担体（载体）、目标物和配体、接枝手臂亲和层析琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶和硅胶等。介质商品种类：Sepharose2B（2%）Sepharose4B（4%）、Sepharose6B（6%）经过交联而增加机械强度的琼脂糖SepharoseCL-2B、SepharoseCL-4B、SepharoseCL-6B载体亲和层析①酶-底物类似物，抑制剂，辅因子；谷胱甘肽-谷胱甘肽-S-转移酶（GST），GST融合蛋白②抗体-抗原——免疫亲和层析③凝集素-多糖，糖蛋白，细胞表面因子受体；④核酸-互补碱基序列，核酸多聚酶，核酸结合蛋白；⑤三嗪类色素-脱氢酶、激酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶等——色素亲和层析⑦肝素-脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白等⑧过渡金属离子：可与N,S和O等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基发生亲和结合作用——金属螯合层析配基与目标物亲和层析当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。需要在配基与载体连接一个“接枝手臂”，以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子有效的亲和结合。接枝手臂金属螯合层析层析介质中连接有可螯合基团，如：亚氨基二乙酸（NH2CH2(COOH)2

，IDA），与某些金属离子络合后，可以吸附某些蛋白质（金属螯合介质能与蛋白质中的组氨酸上的咪唑基及半胱氨酸上的巯基结合）。不同蛋白分子形成的配位键的强度各异，从而起到分离纯化作用。原理金属螯合层析Immobilized-metalaffinitychromatography(IMAC)wasfirstusedtopurifyproteinsin1975(Porathetal.1975)usingthechelatingligand

iminodiaceticacid(IDA,Figure4).IDAwaschargedwithmetalionssuchasZn2+,Cu2+,orNi2+,andthenusedtopurifyavarietyofdifferentproteinsandpeptides(Sulkowski1985).IDAhasonly3metal-chelatingsitesandcannottightlybindmetalions.Weakbindingleadstoionleachinguponloadingwithstronglychelatingproteinsandpeptidesorduringwashsteps.Thisresultsinlowyields,impureproducts,andmetal-ioncontaminationofisolatedproteins.Nitrilotriaceticacid(NTA)isatetradentatechelatingadsorbentthatovercomestheseproblems.金属螯合层析树脂的种类金属螯合层析①NTAoccupiesfourofthesixligandbindingsitesinthecoordinationsphereofthenickelion,leavingtwositesfreetointeractwiththe6xHistag(Figure5).②NTAbindsmetalionsfarmorestablythanIDAandretainstheionsunderawidevarietyofconditions,especiallyunderstringentwashconditions.③Theunique,patentedNTAmatricescanthereforebind6xHis-taggedproteinsmoretightlythanIDAmatrices,allowingthepurificationofproteinsfromlessthan1%ofthetotalproteinpreparationtomorethan95%homogeneityinjustonestep(Janknechtetal.1991)④ThehighsurfaceconcentrationoftheNTAligandissufficientforthebindingofapproximately5–10mgof6xHis-taggedproteinpermilliliterofresin.NTA固定金属离子亲和树脂的特点疏水作用层析原理：利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大小不同，而被吸附到连接有疏水基团的层析介质上。离子强度增大可增强吸附能力，因此常常在2M或3MNaCl/硫酸铵溶解样品，洗脱时可通过降低盐浓度进行梯度洗脱。疏水层析介质：正丁基-Sepharose、正辛基-Sepharose苯基-Sepharose三、层析分离的基本原理

（二）分配层析原理：其固定相和流动相都是液体，其原理类似于液液萃取，利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。其中，固定相是由固定液与载体结合后形成的。正相层析：固定相为极性，流动相为非极性；反相层析：固定相为非极性，流动相为极性。分配层析主要用于分离小分子化合物，在蛋白质化学中并不常用。三、层析分离的基本原理

（三）凝胶过滤层析原理：根据物质分子大小不同而进行分离的层析技术，又称分子筛层析。由于大分子和小分子在通过层析柱时，所通过得路径不同（大分子进入空隙，小分子进入孔内），流出层析柱的时间不同，从而得到分离。其固定相为凝胶，流动相可根据实验需要选择不同的缓冲溶液。凝胶过滤层析介质Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200Sepharose-琼脂糖凝胶2B,4B,6BSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400主要用于脱盐、分级分离和分子量测定等。样品液洗脱液洗脱液四、层析过程和仪器设备（1）装柱（2）平衡（equilibrium)（3）上样(loading)（4）洗涤(washing)

（5）洗脱(elution)（6）清洗与再生1.层析过程四、层析过程和仪器设备

1.层析过程调糊：50%一次连续加入悬浮液打开出口阀：层析剂沉降排除空气检查均匀度（1）装柱四、层析过程和仪器设备

1.层析过程用与样品相同的缓冲液对层析柱进行平衡，直到电导率稳定为止。缓冲液体系包括：缓冲液种类和浓度、pH及盐浓度。（2）平衡（equilibrium)四、层析过程和仪器设备

1.层析过程样品处理：溶解选择合适的缓冲液种类pH盐浓度调整样品浓度过滤：除去不溶物流速：根据样品浓度与吸附速度而定上样量：80%交换容量（3）上样(loading)四、层析过程和仪器设备

1.层析过程采用与上样缓冲液相同的缓冲液体系进行洗涤——除去吸附在树脂表面的蛋白。有时可加入适量表面活性剂（0.1-0.5%)；洗涤体积：根据流出液蛋白浓度而定（A280<0.05）（4）洗涤(washing)四、层析过程和仪器设备

1.层析过程按操作方式A.恒定洗脱(isocraticelution)B.分步洗脱(stageelution)C.梯度洗脱(gradientelution)按洗脱机理改变缓冲液盐浓度改变缓冲液pH改变缓冲液盐浓度和缓冲液pH添加剂：表面活性剂、尿素、盐酸胍洗脱体积：5倍床体积以上（5）洗脱(elution)——离子交换层析A.恒定洗脱B.分步洗脱C.梯度洗脱四、层析过程和仪器设备

1.层析过程按洗脱机理可分为：（1）竞争性洗脱：利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标物。例1：GST融合蛋白亲和层析，用还原型谷胱甘肽为洗脱剂；例2：带有His标签的蛋白质的金属鳌和亲和层析，用咪唑溶液为洗脱剂）（2）非竞争性洗脱：通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类等物化性质降低目标物与亲和介质的吸附能力。pH洗脱离子强度洗脱降低洗脱液极性——不会使蛋白变性促溶性洗脱——可使蛋白变性按洗脱方式可分为：梯度洗脱阶段式洗脱（5）洗脱(elution)——亲和层析pH洗脱

——利用BSA-Sepharose4B亲和层析柱分离抗BSA血清中不同抗体四、层析过程和仪器设备

1.层析过程2mol/L的盐离子强度酸：醋酸，盐酸碱：氨水，氢氧化钠促溶剂：6-8M尿素，6M盐酸胍极性溶剂：20%乙醇表面活性剂：吐温-80缓冲液平衡（6）清洗与再生四、层析过程和仪器设备

2.仪器设备（1）普通（2）高级四、层析过程和仪器设备

2.仪器设备（1）泵（2）层析柱（3）检测器①紫外吸收检测（260nm/280nm/230nm）②电导检测③pH检测（4）阀门（5）组分收集器（6）记录仪五、具体应用1.猪胰蛋白酶的离子交换层析2.利用谷胱甘肽-亲和层析树脂纯化GST-融合蛋白3.带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化五、具体应用

1.猪胰蛋白酶的离子交换层析猪胰蛋白酶等电点约为pH10.8上样缓冲液：0.01mol/L,pH5.0柠檬酸钠缓冲液离子交换剂种类：CM-纤维素离子交换树脂洗涤缓冲液：0.01mol/L,pH5.0柠檬酸钠缓冲液

洗脱缓冲液：0.05mol/L,pH5.0，柠檬酸钠缓冲液0.1mol/L,pH6.0，柠檬酸钠缓冲液洗脱方式：分步洗脱(stageelution)五、具体应用

1.猪胰蛋白酶的离子交换层析层析曲线五、具体应用

1.猪胰蛋白酶的离子交换层析纯化步骤总蛋白量（mg）总酶活（U）比活（U/mg）收率（％）

纯化倍数

胰酶激活后样品100500.51001.0透析后上柱前样品80480.6961.2离子交换层析后的洗脱2

20402.0804.0纯化表格五、具体应用

1.猪胰蛋白酶的离子交换层析SDS-聚丙烯酰胺电泳检测结果五、具体应用

2.利用谷胱甘肽-亲和层析树脂纯化GST-融合蛋白GST：谷胱甘肽-S-转移酶谷胱甘肽-亲和层析树脂TerminalstructureofGlutathioneSepharose.GlutathioneisattachedtoSepharosebycouplingtotheoxiranegroupusingepoxy-activation.ThestructureofglutathioneiscomplementarytotheglutathioneS-transferasebindingsite.GST结合位点GST：谷胱甘肽-S-转移酶谷胱甘肽-亲和层析树脂GST-融合蛋白的表达和纯化流程

GSTGST-融合表达载体GST-融合表达质粒的构建过程GST-融合蛋白的纯化和GST标签的去除Bindingbuffer:1×PBS(140mM

NaCl,2.7mM

KCl,10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.3)Elutionbuffer:50mM

Tris-HCl,10mM

reducedglutathione,pH8.0SDS检测结果五、具体应用

3.

带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化五、具体应用

3.

带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化①常用的表达载体②外源基因片段克隆到表达载体上③表达方式的鉴定④表达条件的优化⑤带有HIS-Tag重组蛋白的纯化⑥纯化结果五、具体应用

3.

带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化①常用的表达载体pET43.1a载体

五、具体应用

3.

带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化PshAIBamHIPCR扩增PshAIandBamHI双酶切连接②表达质粒的构建五、具体应用

3.

带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化Fig.5菌株origami(pET-ES)表达方式鉴定的SDS电泳分析1.origami(pET43.1a)（上清）2.origami(pET-ES)（上清）3.origami(pET-ES)（沉淀）4.origami(pET43.1a)（沉淀）M.ProteinMWMarkerkDaM12