生物制药第二章生物制药技术通论模块01生物药物的制备技术

第二章生物制药技术通论第一节

生物药物的制备技术第二节

发酵工程制药技术第三节

细胞工程制药技术第四节

酶工程制药技术第五节

基因工程制药技术第一节

生物药物的制备技术一、材料选择二、材料的预处理三、提取技术四、固液分离技术五、纯化、结晶六、浓缩、干燥一般工艺程序生物材料胞内产物胞外产物细胞碎片提取液浓缩液初步分离产物高度纯化产物产品（原料药）细胞破碎浓缩提取技术沉淀、膜分离层析、电泳、结晶浓缩、干燥一般工艺程序RETURN固液分离技术固液分离技术选择原则：

1、来源丰富、成本低、目的物含量高、易于分离纯化的材料

材料来源丰富，而含量不高；或材料来源丰富、含量高，但材料的杂质含量太多，分离纯化手续繁琐，以致影响质量和收率，反而不如采用低含量易于操作的原料；

2、种属特异性、发育阶段、生理状态、解剖部位等因素的影响

种属特异性影响到原料中待提取蛋白质的含量、结构、生物学活性及其抗原性。例如：来源于猪垂体的生长素对人体无效，不能用于人体。被提取蛋白质的原料中的含量还受到原料解剖部位的影响。例如：猪胰脏尾部含激素较多，猪胰脏头部含消化酶较多，单独收集胰头提取消化酶，收集胰尾提取激素，有利于提高产率。一、材料的选择P17RETURN二、生物材料的预处理——

组织与细胞的破碎方法1、机械法

常用器械：机械捣碎机、匀浆器、研钵等。机械捣碎机适用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶和芽等材料破碎，但不适用于大分子的提取产物。匀浆器破碎细胞的程度比机械捣碎机高，主要用于少量样品的制备。研钵多用于细菌或其他坚硬植物材料，研磨时加入少量石英砂、玻璃粉等研磨剂，有利于提高研磨效率。2、物理法常用方法：反复冻融法、急热骤冷法、超声波处理、加压破碎法。反复冻融法是先将样品深冷至－20～－15℃使之凝固，再缓慢地融化，反复多次可使大部分细胞及细胞内颗粒破坏，常用于处理动物性材料，但脂蛋白会变性失活。急热骤冷法是将样品投入沸水中，于90℃左右加热数分钟，立即置冰水浴中使其迅速冷却，则绝大多数细胞被破坏。超声波处理是利用超声波产生的机械振动使细胞破碎，适用于微生物材料。其缺点是可导致对超声波敏感蛋白失活，另外超声波产生的热量亦可能使热敏蛋白质失活。加压破碎法是利用气压或水压破碎细胞，每小时可以处理数十乃至数千升的样品，适用于微生物发酵工业的生产。二、生物材料的预处理——

组织与细胞的破碎方法3、化学法和酶法

方法：有机溶剂法、自溶法、酶解法、表面活性剂处理法。有机溶剂法是于0℃以下在粉碎后的新鲜材料中加入5～10倍量的丙酮，迅速搅拌，可破碎细胞，亦使蛋白质与脂质分开，有利于进一步的纯化。表面活性剂处理法是利用细胞膜对表面活性剂不稳定的原理来破碎细胞。如：十二烷基硫酸钠（SDS）、氯化十二烷吡啶、去氧胆酸钠。自溶法是利用细胞自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。自溶法所需的时间长，不易控制，难以在工业上使用。酶解法适用于细菌、植物等含细胞壁的材料，如：利用溶菌酶、纤维素酶、半纤维素酶、蜗牛酶、酯酶等专一性的酶水解细胞壁，得到细胞的内含物。二、生物材料的预处理——

组织与细胞的破碎方法RETURN（一）提取类型与影响因素三、提取技术1、提取类型（1）固液提取（又称浸取、浸提、抽提）：目标物在细胞中呈固相或与固体结合存在，提取时由固相转入液相，称为固—液萃取，常用萃取剂为水。（2）液液提取（又称萃取）：目标物已呈液相存在，萃取时由液相转入另一液相，称为液—液萃取，因常用有机溶剂作为萃取剂，所以也叫溶剂萃取。三、提取技术2、影响因素（1）溶解度的大小：选择合适溶剂，一般遵守“相似相溶”的原则。（2）扩散速度：增加温度、降低溶液的黏度、增加扩散面积、减少扩散距离、搅拌和延长时间等。提取原则：“少量多次”，对于等量的提取溶液，分多次提取比一次提取的效果好。（二）提取方法三、提取技术1、水溶液提取2、表面活性剂提取3、有机溶剂萃取1、水溶液提取三、提取技术水溶液（一般为缓冲液）是生物药物提取中最常用的溶剂，可以利用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液进行提取。“盐溶”作用：盐离子的存在能减弱生物分子间离子键及氢键的作用力，稀盐溶液可促进蛋白质等生物大分子的溶解。“盐解”作用：某些与细胞结构结合牢固的生物活性物质，在提取时采用高浓度盐溶液（如4mol/L盐酸胍，8mol/L脲或其他变性剂）。2、表面活性剂提取三、提取技术一些采用水盐系统难于提取的蛋白质、酶、核酸，可采用表面活性剂提取。离子表面活性剂（如胆酸盐、十二烷基磺酸钠）如：十二烷基磺酸钠（SDS），利于破坏核酸与蛋白质的离子键合，对核酸酶又有一定抑制作用，因此常用于核酸的提取。非离子表面活性剂（如吐温60、吐温80等）。3、有机溶剂萃取三、提取技术对于水不溶性的脂类、脂蛋白、膜蛋白结合酶等，可采用有机溶剂进行提取。常见的有机提取溶剂有乙醇、丙酮、丁醇。单一溶剂分离法多种溶剂组合分离法如先用丙酮，再用乙醇，最后用乙醚提取，可以从动物脑中依次分离出胆固醇、卵磷脂和脑磷脂。3、有机溶剂萃取三、提取技术常用丙酮处理某些生化原材料，制成“丙酮粉”。作用：使材料脱水、脱脂；细胞结构松散，增加稳定性，有利于活性成分的提取；同时又减少了体积，便于贮存和运输。应用丙酮粉提取，可以减少提取液的乳化程度及黏度，有利于离心与过滤操作。4、双水相萃取技术三、提取技术两种亲水性聚合物混合溶于水中，低浓度时可以得到均匀单项液体体系；随着各自浓度的增加，溶液会变得浑浊；当各自达到一定浓度时，就会产生互不相溶的两相。两相都以水分为主，所以形成高聚物-高聚物双水相体系。类型：（1）高聚物/高聚物双水相体系（2）高聚物/无机盐双水相体系（3）低分子有机物/无机盐双水相体系（4）表面活性剂双水相体系双水相的形成

如葡聚糖与聚乙二醇按一定比例与水混合，静置平衡后，分成互不相溶的两个水相，上相富含PEG，下相富含葡聚糖

5、超临界流体萃取技术三、提取技术在超临界区，无论压力有多高，分子之间的距离会缩小，密度会增大，但分子之间都有一定的距离，依旧不会变成液体。这种既不是气体也不是液体的物质状态，称为“流体”，即超临界流体。常见的超临界流体还有二氧化碳、乙烷、丙烷等。超临界状态下的流体对溶质的溶解度大大增加，是良好的分离介质，根据这些特性发展起来的萃取技术称为超临界流体萃取技术。80年代超临界二氧化碳萃取技术泛用于香料的提取。90年代后，超临界二氧化碳萃取技术用于从药用植物中提取药用有效成分等。CO2超临界萃取装置四、固液分离技术固液分离技术膜分离技术过滤分离技术离心分离技术传统过滤技术离心过滤技术离心沉降技术（一）过滤分离技术1、定义：以多孔性物质为过滤介质，在外力（重力、压力或离心力）作用下，流体（液体或气体）及小颗粒固体通过介质孔道，而大的固体颗粒被截留，从而实现流体与固体颗粒分离的技术。2、分类：（1）重力过滤（2）加压过滤（3）真空过滤（4）离心过滤（5）膜过滤利用悬浮液自身的重力为过滤动力，速度慢，效率低利用气压或泵为过滤动力，推动液体前进，常用的方法反向端抽真空，形成负压，抽出液体，设备成本高利用离心力作为料液推动力，速度快，成本高利用选择性半透膜作为分离介质层，允许混合物中的某些组分透过而截留其他组分的一种分离技术。重力过滤加压过滤真空过滤离心过滤（一）过滤分离技术3、过滤介质和助滤剂（1）过滤介质：滤布或膜（2）助滤剂：要求为惰性物质、无毒、有一定细毒及硬度，成本低廉。常用有：硅藻土、纸浆、石棉、纤维素等过滤介质介质种类材料应用无定形颗粒煤渣、沙粒、活性炭澄清过滤成形颗粒烧结金属、玻璃、塑料澄清过滤非金属织布类棉布、化学纤维普通过滤金属织布类不锈钢丝网普通过滤无纺品滤纸、无纺滤布、滤膜精密过滤RETURN（二）离心分离技术1、定义离心分离技术是利用旋转产生的离心力的作用，促使不同大小、不同密度的颗粒分离的技术。2、分类按分离原理分2种：离心沉降、离心过滤按工作目的分2种：制备、分析按离心速度分3种：低速、高速、超速离心机低速离心机高速冷冻离心机不同转速离心机比较类型低速离心机高速离心机超速离心机转速rpm<800010000~2500025000~150000RCF（×g）<1000010000~100000100000~1000000分离形式固液沉淀固液沉淀密度梯度离心应用范围收集易沉淀大颗粒（细胞碎片、颗粒）分离硫胺沉淀物、免疫沉淀物等分离细胞器、病毒、核酸、蛋白质分子离心转速与离心力FC：离心力m：粒子质量r：粒子到轴心的距离ω：角速度五、分离纯化技术（一）生化制药工艺中分离纯化特点(1)生物材料组成复杂(2)目的物含量低(3)易变性、失活(4)分离方法有很大经验成分(5)步骤多，逐级分离(6)产品验证与化学上纯度概念不完全相同（二）分离纯化原理

P19（1）利用溶解度不同的纯化方法盐析法、有机溶剂法、等电点沉淀法、加热变性法。（2）利用分子结构和大小不同的纯化方法凝胶色谱法、超滤法。（3）利用电离性质不同的纯化方法电泳法、等电聚焦。（4）利用生物功能专一性（亲合性）亲和色谱（层析）法。（5）根据吸附特性不同的纯化方法吸附色谱（层析）法。（三）选择原则（1）粗品分离大处理量，相对低分辨率盐析，分级沉淀，萃取，超滤（2）精制高分辨率多种色谱层析法，亲和层析，HPLC，FPLC，电泳或等电聚焦，结晶纯化（purification）：是指利用目标物的特性将其从混杂的物质中分拣出来的过程及技术。一般分为初级纯化和精细纯化。（四）分离纯化方法1、沉淀技术2、膜分离技术3、层析技术4、电泳技术5、结晶技术初级纯化技术，如盐析沉淀、等电沉淀、有机溶剂沉淀、超滤、透析等精细纯化技术，如凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、区带电泳、等电聚焦等最后的纯化技术1、沉淀技术Precipitation沉淀可分为晶形沉淀和非晶形沉淀两大类型。生物大分子沉淀有其特殊的性质，是利用溶解性不同实现分离，属于非晶形沉淀，为分子凝集作用的结果。（1）盐析沉淀法（2）等电沉淀法（3）有机溶剂沉淀法（4）成盐沉淀法（5）选择性变性沉淀法（1）盐析沉淀法定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高，要除盐①原理两种现象：盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大。盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小。盐析沉淀法盐析沉淀的机制：破坏生物分子（蛋白质）表面的水化膜，使得分子凝集沉淀。②盐的选择盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子更为明显。

PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I―

NH4+＞K+＞Na+＞Li+

常用：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等③盐的浓度各种活性成分分子的颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不相同。常用“饱和度”来表示中性盐的的浓度。如：25℃时(NH4)2SO4的饱和浓度为4.1mol/L，定义它为100%饱和度。操作：直接投固体粉末、加入硫酸铵饱和溶液。盐析沉淀—硫酸铵饱和度表200ml初始液，欲使其饱和度达到30%，需加入硫酸铵多少克？在此基础上，欲使其饱和度达到80%，需加入硫酸铵多少克？④影响盐析的因素A．不同溶质，B．溶质的浓度，C．pH值，D．温度。⑤盐析方法1、分部盐析法2、重复盐析法3、反抽提法一定的盐浓度下将目的蛋白夹带一定量的杂蛋白一同沉淀。将沉淀用较低浓度盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白。分部盐析法反抽提法(RNA聚合酶)⑥注意事项A．防止“局部过浓”B．温度（室温）C．沉淀需要经一段老化时间后进行分离。（2）等电沉淀法在等电状态时，带电物质颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种物质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到等电点使之沉淀。在等电点时，两性离子的净电荷为零（即正负电荷相等），此时分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等电沉淀法1．不同的蛋白质，具有不同的等电点。2．同一种蛋白质在不同条件下，等电点不同。

3．目的药物成分对pH值的要求。

4．考虑采用几种方法结合来实现沉淀分离。（3）有机溶剂沉淀法用与水可混溶的有机溶剂，甲醇、乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。冷乙醇法是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法，不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种成分，而且有抑菌、清除和灭病毒的作用。有机溶剂沉淀法（4）成盐沉淀法生物大分子和小分子都可以生成盐类复合物沉淀。与金属生成沉淀：生物分子中的酸性基团可与多种金属盐发生沉淀反应，包括Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+、Zn2+、Li2+等。与有机酸生成沉淀：生物分子中的碱性基团可与有机酸发生沉淀反应，如苦味酸、鞣酸、三氯乙酸等。苦味酸（PICRICACID）鞣酸（CHEBULINICACID）三氯乙酸（TRICHLOROACETICACID）（5）选择性变性沉淀法这是个特殊的方法，它的目的是利用生物分子对某些理化因素（如变性剂、热、酸碱性）的敏感度不同，而有选择地使之变性沉淀，去除杂质，保留目标物。选择性变性剂：表面活性剂、重金属盐、某些有机酸、酚类、卤代烷等。选择性热变性选择性酸碱变性选择性变性沉淀法pH对不同蛋白质溶解性的影响选择性热变性：黑曲霉发酵制备脂肪酶时，混杂有大量淀粉酶。40℃，pH3.4，2.5h淀粉酶90%沉淀脂肪酶不受影响二者分离，利于以后的脂肪酶纯化温度对不同酶活性的影响此类沉淀方法的缺点：选择性不强使用时一定注意选择的方法对目标物无害；沉淀后尽快分离，去除沉淀剂2、膜分离技术借助于膜而实现各种分离的过程称为膜分离。特点：①高效：由于膜具有选择性，它能有选择性地透过某些物质，而阻挡另一些物质的透过。选择合适的膜，可以有效地进行物质的分离，提纯和浓缩。②节能：多数膜分离过程在常温下操作，被分离物质不发生相变,是一种低能耗，低成本的单元操作。③过程简单、容易操作和控制。④不污染环境。膜分离技术类型（1）透析（2）微孔滤膜过滤技术（3）超过滤（1）透析透析是采用半透膜作为滤膜，使试样中的小分子经扩散作用不断透出膜外,而大分子不能透过被保留在透析袋内，从而达到大小分子分离的一种膜过滤方法。①半透膜的材料兽类的膀胱、硝酸纤维素膜、玻璃纸。②应用除去小分子物质及其杂质，脱盐。透析袋

③透析过程及注意点A.预处理：煮沸1h；B.透析前，对装有试液的透析袋检查是否有泄漏；C.透析袋装一半左右，防止膜外溶剂因浓度差渗入将袋涨裂或过度膨胀使膜孔径改变；D.搅拌；定期或连续更换外部溶剂可提高透析效果。透析袋的保存透析袋

使用方法透析（2）微孔滤膜过滤技术①微孔滤膜的种类再生纤维素纤维素酯膜:硝酸纤维素酯膜.醋酸纤维素酯膜.混合纤维素酯膜聚四氟乙烯膜聚氯乙烯膜超细玻璃纤维滤膜②应用0.01～0.05μm：噬菌体、病毒或大的胶体颗粒。0.1μm：试剂的超净、分离沉淀和胶体悬液。0.2μm：高纯水的制备、制剂除菌、细菌计数、空气病毒定量测定等。0.45μm：水的超净化处理、色谱分析时流动相的处理、放射免疫测定、光测介质溶液的净化以及锅炉水中Fe(OH)3的分析等。③设备类型注射式过滤器玻璃滤器平板滤器筒式滤器注射式过滤器全玻璃微孔滤膜过滤器抽滤装置平板滤器筒式滤器④操作与注意事项A.过滤系统的严密性B.滤膜的湿润C.过滤速度D.过滤系统的清洗和消毒E.串滤技术（3）超滤技术超过滤：简称超滤，是一项分子级膜分离手段，以压力差为推动力将不同分子量的物质进行选择性分离。①用途：A.大分子物质的脱盐和浓缩，以及大分子物质溶剂系统的交换平衡B.大分子物质的分级分离C.生化制剂或其它制剂的去热原处理中空纤维滤芯②超滤装置UF-15中空纤维超滤装置

超滤装置

工业化超滤设备

固定相：表面积很大的或多孔性固体。如凝胶、树脂等。流动相：液体或气体。分为液相色谱和气相色谱。3、层析技术chromatography，也称色谱技术、层离技术。定义：利用混合物中各个组分理化性质的差异，使其按照不同比例分配到两相中，而达到分离的目的。层析技术的分类吸附层析凝胶过滤层析离子交换层析亲和层析液相层析气相层析高效液相层析薄膜层析薄板层析层析方式柱层析不同支持介质（1）吸附层析adsorptionchromatograpby利用固定相吸附剂对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。优点：A.设备简单、操作简便、价廉、安全。B.少用或不用有机溶剂，吸附过程中pH变化小，较少引起生物活性物质的变性失活。缺点：A.

选择性差，收率不高。B.一些无机吸附剂性能不稳定。几种常用的吸附剂无机：白陶土、氧化铝、硅胶、硅藻土有机：活性炭、纤维素、大孔吸附树脂等常用吸附剂的吸附力的强弱顺序为：活性炭>氧化铝>硅胶>氧化镁>碳酸钙>磷酸钙>石膏>纤维素>淀粉和糖。活性炭白陶土氧化铝大孔吸附树脂可分为非极性、中等极性、极性和强极性吸附剂四类。

美国罗姆-哈斯公司：Amberlite系列；日本三菱化成公司：Diaion系列。吸附剂及被吸附物极性对吸附的影响“类似物容易吸附类似物”的原则：极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质；极性吸附剂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质；非极性吸附剂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质。洗脱剂的选择极性溶质：极性大的溶剂洗脱能力就大；非极性溶质：极性小的溶剂洗脱能力就大。常用洗脱剂排序（极性增大）：

石油醚<甲苯<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水<乙酸

氧化铝或硅胶(极性强)为吸附剂洗脱剂从极性低的开始逐渐增加极性。次序：石油醚、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水、乙酸。活性炭(非极性)为吸附剂洗脱剂从极性高的开始逐渐降低极性。次序：水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿。吸附层析装置（2）凝胶过滤层析

gelchromatography凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。特点：该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。原理：凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子；小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。凝胶过滤层析原理凝胶过滤适合于分离蛋白质、酶、核酸、抗体等生物大分子（3）离子交换层析

ionexchangechromatography基本原理：离子交换层析：利用溶液中带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。带电粒子与离子交换剂间的作用力是静电力。

电荷密度、电荷种类离子交换层析原理离子交换剂离子交换剂：由惰性的不溶性载体、功能基团和平衡离子组成。阳离子交换剂：平衡离子带正电荷。阴离子交换剂：平衡离子带负电荷。R-X++Y+R-Y++X+R-表示阳离子交换剂的功能基团和载体；X+

为平衡离子；Y+为交换离子。

离子交换树脂吸附和洗脱过程（1）X+为平衡离子，YH+及Z+为待分离离子；（2）YH+和Z+取代X+而被吸附；（3）加碱后YH+失去正电荷，被洗脱；（4）提高X+的浓度取代出Z+离子交换的基质带有正电荷的称之阴离子交换树脂，如：二乙氨基乙基纤维素，DEAE-纤维素）；带有负电荷的称之阳离子交换树脂，如：羧甲基纤维素，CM-纤维素）。基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。目的物是弱酸性或弱碱性的小分子物质时，宜选用强酸强碱树脂（氨基酸的分离）。蛋白质、酶和其它生物大分子的分离多采用弱碱或弱酸性树脂，减少生物大分子的变性，利于洗脱，提高选择性。

树脂的选择离子交换树脂的命名强酸类

1～100号；弱酸类

101～200；强碱类201～300；弱碱类301~400；中强酸类401～500交联度：是合成载体骨架时交联剂重量的百分数，用“×”将树脂编号与交联度分开。弱酸101×4其交联度为4％。国内常用树脂命名：724；732；717常用树脂724；弱酸阳离子交换树脂732；强酸阳离子交换树脂717；强碱阴离子交换树脂常用的离子交换纤维素羧甲基纤维素（CM-C）：弱酸性阳离子交换纤维素，pK=3.6。二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-C）：强碱型阴离子交换纤维素，pK=9.1。

离子交换层析树脂的树脂的预处理A.物理处理：去杂，过筛。B.化学处理：用8～10倍的1mol/L盐酸或氢氧化钠溶液交替浸泡。

氨基酸分离前树脂的处理不同类型树脂的处理树脂的再生

树脂再生：使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。

再生过程：A.去杂，大量水冲洗，除去物理吸附的杂质。B.用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质。C.转型：离子交换纤维素的处理和再生

酸碱浓度要适当降低，处理时间也从4h缩短为0.3~1h。以交换缓冲液平衡。注意：不耐酸，用酸处理的浓度和时间须小心控制。（4）亲和层析

(AffinityChromatography)利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的层析技术。

适用:从成份复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。抗体——抗原酶——底物DNA或RNA互补链特点经过一次处理可得到高纯度活性物质；特异性强、分离效果好、分离条件温和；亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。A配基B配体原理（1）配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。（2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质.（3）样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。技术要点（1）找与底物专一可逆结合的配基；（2）将配基通过共价键偶联到基质；（3）配基与底物吸附；（4）洗脱目标物。

亲和层析层析装置（试验室和工厂）4、电泳技术（1）原理各种带电分子（如蛋白质）在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度作用下，单位时间内移动的距离（即迁移率，Rm值）为常数，是该带电粒子的物化特征性常数。电泳技术电泳基本设备电泳仪主要功能是提供稳压稳流直流电源，就是一直流稳压稳流器电泳槽电泳系统的核心部分，各种支持介质的容器，电泳行为发生处电泳槽关键词：1、电极2、胶板3、上槽4、下槽5、样品池6、点样7、前沿8、Rm值（2）电泳类型①移动界面电泳②区带电泳③等电聚焦电泳④等速电泳区带电泳在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。按支持物的物理性状不同，又可分为:A.纸电泳

B.纤维膜电泳

C.粉末电泳

D.凝胶电泳

E.丝线电泳电泳结果图电泳图谱：是在电泳后经染色获得的。染色的方法依据分离的分子性质决定等电聚焦电泳等电聚焦电泳是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。5、结晶技术

（Cystallization）结晶：从液相或气相生成形状一定，分子（原子、离子）有规则排列的晶体的现象。（1）特点

①选择性高

②纯度高（2）结晶过程①形成过饱和溶液②晶核形成（有时需添加晶种）③晶体生长

过饱和是结晶的推动力

一次结晶得到的产品总会有一些杂质，为了提高晶体的纯度，必须将晶体用合适的溶剂溶解再次结晶，这个过程称为重结晶。①冷却法②蒸发法③盐析结晶法④透析结晶法⑤有机溶剂结晶法⑥等电点法⑦化学反应结晶法调节溶液的pH或向溶液中加入反应剂，生成新物质，结晶析出。（3）过饱和溶液的形成(结晶方法)温度诱导法盐析结晶法透析结晶法等电点法化学反应结晶法

综合利用结晶设备浓缩结晶罐冷冻结晶系统串联结晶系统各种结晶胱氨酸酪氨酸细胞色素P450血清白蛋白六、浓缩、干燥（一）浓缩技术

使溶液中溶剂蒸发、溶液浓度增大的过程。1、蒸发浓缩2、冷冻浓缩3、膜过滤浓缩蒸发浓缩凡是液体均可用蒸发的方法进行浓缩。传统蒸发，就是加热使液料沸腾而使汽体飞入空间。现代蒸发则改用低温、低压蒸发的方法，以免损坏有效成分。旋转蒸发仪（器）冷冻浓缩利用冰与水溶液之间的固液相平衡原理的一种浓缩方法。冷冻浓缩的操作包括两个步骤