仪器分析课件第7章分子发光分析法

第7章分子发光分析法molecularluminescenceanalysis1

2分子发光分析法包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光分析法。这三种都是通过测量被激发的分子回到基态时所发射的光辐射来进行分析的，不同之处在于光谱产生的机制。分子受光子激发后，由第一电子激发单重态回到基态的任一振动能级伴随的光辐射称为分子荧光。激发态分子从第一激发三重态回到基态伴随的光辐射称为磷光。分子受化学能激发后产生的发光现象称为化学发光。7-1概述37-2分子荧光分析法及其基本原理分子荧光和磷光通常基于

或

n形式的电子跃迁，因此都需要有不饱和官能团的存在。在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不同的自旋状态，常用电子自旋状态的多重性描述。1.电子自旋状态的多重性一、分子荧光和磷光的产生4概念：单重态（S）、基态（S0）、第一激发单重态（S1）、第二激发单重态（S2）、三重态（T）、第一激发三重态（T1）、第二激发三重态（T2）1.电子自旋状态的多重性5热能、电能、化学能或光能S0：基态S1、S2：第一（二）电子激发单重态T1、T2：第一（二）电子激发三重态υ：基态和激发态的振动能级电子自旋状态的多重性62.无辐射跃迁当激发态分子返回基态时，如果不伴有发光现象，该过程称为无辐射去激或无辐射跃迁，该过程包括振动弛豫（VR）、内转换（IC）和系间窜跃（ISC）。7

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光磷光内转换外转换系间跨越振动弛豫无辐射跃迁

激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-8～10-6s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；小结：分子荧光和磷光的产生8S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫9荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？荧光(磷光)的激发光谱曲线激发光谱反映了激发波长与荧光强度之间的关系，为荧光分析选择最佳激发波长提供依据。固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线。简而言之，固定发射波长，找激发波长。二、分子荧光分析的基本原理1.激发光谱和发射光谱10荧光(或磷光)发射光谱固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线。11激发光谱与发射光谱的关系

（1）Stokes(斯托克斯)位移

激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。

（2）荧光光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如

2

,

1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如

2′)。

（3）

镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。12200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱13

小结：什么是分子荧光发射光谱与荧光激发光谱?(1)荧光激发光谱:固定荧光发射波长,扫描荧光激发波长,所得到的激发波长与荧光强度的一维光谱曲线。荧光发射光谱:固定荧光激发波长,扫描荧光发射波长,所得到的发射波长与荧光强度的一维光谱曲线。

(2)荧光发射光谱是供应能量使试样增加能量后，针对发射的荧光所记录的光谱,荧光激发光谱是以荧光为光源照射试样后,针对试样吸收能量所记录的光谱。14思考题：简述分子荧光光谱常与其吸收光谱呈镜像对称关系,而又不完全对称,且荧光光谱的波长较长的理由。[答](1)物质的吸收光谱是物质吸收光能后,由基态跃迁至较高激发态的各个振动能级，产生吸收光谱的形状是由激发态的能级分布决定的。(2)分子荧光光谱是由基态的振动能级分布决定的。两者情况相似,但又不相同,再加上物质分子在激发态和基态受溶剂作用及环境的影响不同。15荧光量子产率（

）：是物质荧光特性的重要参数，它反映了荧光物质发射荧光的能力，其数值越大，说明物质的荧光能力越强。在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移，系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量子产率，与上述每一个过程的速率常数有关。如外转换过程速度快，不出现荧光发射。2.荧光强度与溶液浓度之间的关系P12816荧光强度If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率

：

If

=

Ia

由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-

bc

)If=

I0(1-10-bc

)=

I0(1-e-2.3bc

)

浓度很低时，将括号项近似处理后：

If=2.3

I0

bc=Kc只有在极稀的溶液中，当

bc

<0.02时才成立，对于浓度较高的溶液，由于自猝灭和自吸收等原因，使荧光强度和荧光物质浓度不呈线性关系。17分子产生荧光必须具备两个条件：物质分子必须具有能吸收一定频率紫外可见辐射的特征结构，分子必须具有吸光的结构吸光后被激发的分子还必须具有高的荧光量子产率，许多吸光物质不一定发荧光，就是由于他们的吸光分子的荧光量子产率不高，而是将其吸收的能量与溶剂分子或其他溶质分子的相互碰撞中消耗掉了，因此不能发生荧光。3.荧光的产生与分子结构的关系18（1）共轭效应

实验证明，容易实现

激发的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少（仅少数高度共轭体系化合物除外）。任何有利于提高

电子共轭程度的结构的改变都将提高荧光效率，并使荧光波长向长波方向移动。共轭效应使荧光增强的原因：主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。19(2)刚性平面结构

实验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。20（3）取代基效应

芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。

a.给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2

、-NR2等，使荧光增强。因为产生了p-

共轭作用，增强了电子共轭程度，导致荧光增强，荧光波长红移。b.吸电子基团，如-COOH、-NO、-CO、卤素等，不能扩大电子共轭程度，反而使S1-T1系间跨越增强，导致荧光减弱，磷光增强。21c.重原子效应：引入质量相对较重的原子出现磷光增强和荧光减弱的现象。

d.

同电子体系相互作用较小的取代基，如-SO3H、-NH3+等，对分子发光只有很小影响。因此给一个发光分子引入磺酸基可以增加分子在水溶液中的溶解度。2223（4）跃迁类型

实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历

或n

激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生

或

n跃迁而得到荧光。在这两种跃迁类型中，

跃迁常能发出较强的荧光（较大的量子产率）。这是由于

跃迁具有较大的摩尔吸光系数（一般比n

大100-1000倍），其次，

跃迁的寿命约为10-7-10-9s，比n

跃迁的寿命10-5-10-7s要短。此外，在

跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的速率常数也较小（S1

T1能级差较大），这也有利于荧光的发射。总之，

跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。P129244.影响荧光强度的因素P130（1）溶剂的影响一般来说，许多共轭芳香烃化合物荧光强度随溶剂极性的增加而增强，且荧光峰波长向长波方向移动。在含有重原子的溶剂如碘乙烷和四溴化碳中，与将这些成分引入荧光物中所产生的重原子效应相似，导致荧光减弱，磷光增强。若溶剂和荧光物质形成氢键或溶剂使荧光物质解离状态改变，则荧光波长和荧光强度也会发生改变。25（2）温度的影响

一般来说，大多数荧光物质的溶液随着温度降低，荧光效率和荧光强度将增加；反之，温度升高荧光效率则下降。如荧光素的乙醇溶液在0ºC以下每降低10ºC，荧光效率增加3%，冷至-80ºC时，荧光效率为100%。这是因为温度降低时，溶液中分子的活动性减弱，溶液的黏度增大，溶质分子与溶剂分子间碰撞机会减少，降低了各种无辐射去活化概率，使荧光效率增加，荧光强度增强。26（3）溶液pH的影响

带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关。不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有所不同，因此，它们的荧光强度和荧光光谱就有一定的差别。

对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物，一方面pH会影响鏊合物的形成，另一方面还会影响鏊合物的组成，因而影响它们的荧光性质。27（4）荧光的猝灭

荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。287-3荧光分析仪器

P131光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器组成：激发光源、样品池、双单色器、检测器。特殊点：两个单色器，光源与检测器通常成直角。29（1）激发光源

在紫外-可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯，此外高功率连续可调染料激光光源就是一种新型荧光激发光源。（2）样品池

荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以方形和长方形为宜。（3）单色器

光栅，激发单色器用于选择激发波长；发射单色器，用于分离出荧光发射波长。（4）检测器

由光电管和光电倍增管作检测器，并与激发光成直角。307-4荧光分析法及其应用由于能产生荧光（磷光）的化合物占被分析物的数量相当有限的，并且许多化合物几乎在同一波长产生光致发光，所以荧光（磷光）法很少用于定性分析。分子发光分析法是最灵敏的分析方法之一，其灵敏度在很多情况下比紫外-可见吸收光谱法要高的多，所以更适合低浓度的分析。317-4-1定量分析方法——工作曲线法（1）校准曲线法FCsFxCx（2）标准对照法（比较法）如果荧光物质的校准曲线通过零点，就可以选择其线性范围内某一浓度的标准溶液，用标准对照法测定。327-4-2应用1.无机化合物的分析

很多无机离子能与一些有机试剂形成荧光络合物而被测定，这种试剂称为荧光试剂，这种方法称为直接荧光法。还有一些无机离子，它们不能形成荧光络合物，但能使其他物质的荧光减弱，可利用荧光猝灭法测定。（1）直接荧光法：铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土（2）荧光猝灭法：氟、硫、铁、银、钴、镍332.有机化合物的分析此外，药物中的胺类、甾族类、抗生素、维生素、氨基酸、蛋白质和酶等大多具有荧光，可用荧光法测定。34357-5化学发光分析法（自学）化学发光是由化学反应提供的能量激发物质产生的光辐射。发生于生物体的化学发光，称为生物发光。利用化学发光而建立起来的方法，称为化学发光分析法。367-5-1化学发光分析法的基本原理1.化学发光分析法的基本原理化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能，而使反应产物分子激发所发射的光。任何一个化学发光反应都应包括化学激发和发光两个步骤。化学发光反应效率

CL，又称化学发光的总量子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学激发效率

CE和激发态分子的发射效率

EM。定义为：

CL=发射光子的分子数/参加反应的分子数=

CE

EMAP*P+hv激活发光37化学发光必须满足如下条件：（1）化学反应必须提供足够的激发能，激发能主要来源于反应焓。（2）要有有利的化学反应历程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。（3）要观察到化学发光，激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分子，而使该分子激发，然后以辐射光子的形式回到基态。（4）由于化学激活的瞬时性，激活能必须由某一步骤单独提供，否则，前一步反应所释放出的能量将会因分子振动而被消耗掉。38

化学发光反应的发光强度IcL以单位时间内发射的光子数表示。它等于化学发光效率

CL与单位时间内起了反应的被测反应物A浓度的变化的乘积，即

ICL(t)=

CL

dcA/dt

式中ICL(t)表示t时刻的化学发光强度，

CL是与分析物有关的化学发光效率dcA/dt是分析物参加反应的速率。2.化学发光的强度397-5-2

化学发光的类型1.直接化学发光和间接化学发光直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。

A+B

C*+DC*

C+h

式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*，当C*跃迁回基态时，辐射光子40间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产物C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁回基态，产生发光。

A+B

C*+DC*+F

F*+EF*

F+h

式中C*为能量给予体，而F为能量接受体。412.气相化学发光

主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。（1）臭氧的化学发光反应（2）氮氧化物的化学发光反应（3）利用氧原子的化学发光反应423.液相化学发光用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽碱、洛粉碱等。例如，利用发光物质鲁米诺，可测定痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce等金属离子437-5-3化学发光的测量仪器化学发光分析法的测量仪器主要包括样品室、光检测器、放大器和信号输出装置。化学发光反应在样品室中进行，样品和试剂混合的方式有不连续取样体系，加样是间歇的。将试剂先加到光电倍增管前面的反应池内，然后用进样器加入分析物。另一种方法是连续流动体系，反应试剂和分析物是定时在样品池中汇合反应，且在载流推动下向前移动，被检测的光信号只是整个发光动力学曲线的一部分，而以峰高进行定量测量。447-5-4化学发光分析法的特点及应用化学发光最显著的特点是：灵敏度高，其检出限可达10-15mol/L线性范围宽，一般可达4-5个数量级操作简单，易于实现自动化所用仪器设备简单，不需要光源和单色器，无光散射及杂散光引起背景值的干扰应用：表7-6和表7-745补充：磷光分析法磷光和荧光都是光致发光，任何发射磷光的物质也都具有两个特征光谱，即磷光激发光谱和磷光发射光谱。其定量分析的依据是在一定条件下磷光强度与磷光物质浓度成正