生物化学概述

一、生物化学概述（一）生物化学研究的基本内容（二）生物化学的发展简史1、阐明三羧酸循环的科学家是BA.J.D.WatsonB.H.A.KrebsC.L.C.PaulingD.J.B.Sumner(2008)2、世界上首次人工合成具有生物活性酵母tRNAAla

的国家是：BA美国B中国C英国D法国(2009)蛋白质化学一、蛋白质的概念和生物学意义二、氨基酸1、氨基酸的基本结构和性质2、根据R基团极性对20种蛋白质氨基酸的分类及三字符缩写三、蛋白质的结构与功能1、肽的概念及理化性质2、蛋白质的初级结构3、蛋白质的高级结构（二级结构、超二级结构和结构域、三级结构、四级结构）4、蛋白质的结构与功能的关系四、蛋白质的理化性质1、蛋白质的相对分子质量2、蛋白质的两性电离及等电点3、蛋白质的胶体性质4、蛋白质的紫外吸收特征5、蛋白质的变性及复性五、蛋白质的分离与纯化1、蛋白质的抽提原理及方法2、蛋白质分离与纯化的主要方法：电泳、层析和离心3、蛋白质的定量方法一、蛋白质的概念和生物学意义蛋白质的概念P36

由氨基酸（AA）之间以肽键相连而成的多肽链，经折叠弯曲形成的具有一定的空间构象和生物学功能的高分子化合物，又简称为功能大分子调节功能,如胰岛素调节糖的代谢催化功能,如淀粉酶、胃蛋白酶的催化作用运输功能,如血红蛋白输送氧传递功能,如叶绿体内的电子传递链运动功能,如肌肉的运动免疫功能,如免疫球蛋白保护功能,如指甲、头发、蹄角等致病作用,如病毒蛋白可致病营养作用，卵清蛋白、酪蛋白蛋白质功能P36各元素的百分比对于大多数蛋白质都较相似，其中N约占16%

。这可用于测定蛋白质的含量——凯氏定氮法请写出凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理，并简单说明在蛋白样品中加入一定量的三聚氰胺（分子式C3H6N6）为什么会导致样品测定值高于实际值的原因。（9分）凯氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法，该方法的原理是将待测物质（如奶粉）在硫酸铜催化下，用浓硫酸消化分解为透明溶液，使各种形态的含氮化合物（蛋白质、氨基酸等）全部转化为铵离子（NH4+）形态，再采用经典的酸碱滴定法测出氮含量，再乘以一定换算系数即为蛋白质含量。这个方法是通过测定样品中的含氮量来推算蛋白质含量的。一般认为蛋白质中的平均含氮量为16%，于是含氮量=蛋白质量×16%，蛋白质量=含氮量/16%=含氮量×6.25。

三聚氰胺是一种重要的化工原料，从分子式可以算出它的含氮量高达66.7%，用凯氏定氮法测牛奶和其他食品中的蛋白质数值时，根本不会区分这种伪蛋白氮。所以加入少许三聚氰胺能显著提高奶粉等食品中的氮含量，导致样品测定值高于实际值，使伪劣产品得以堂而皇之的通过正规渠道流入市场。二、氨基酸一、氨基酸结构通式氨基酸的一般结构特点：

20种蛋白质氨基酸中，除脯氨酸是一种α－亚氨基酸外，其余的都是α

－氨基酸，即其与羧基相邻的α

－碳上有一个氨基；除甘氨酸外，其它蛋白质氨基酸均为L－型氨基酸HCOOHNHC2CH2CH2CH2CH22HNε

αβγδε

氨基注意AA各C原子的编号二、氨基酸的分类

1.编码氨基酸

2.非编码氨基酸

3.非蛋白质氨基酸

氨基酸名称符号R基化学结构等电点分类H3CH3CAla(alanine

)CHCH3H3CCHCH3CH2H3CCHCH3CH2H3CCH2NCH2CH2CH2SCH2H2CH2CCHNCOOHH缬氨酸亮氨酸苯丙氨酸色氨酸蛋氨酸脯氨酸ValProTrpMetLeuIlePhe异亮氨酸(valine)(leucine)(phenylalanine)(tryptophan)(methionine)(proline)(isoleucine)6.025.975.986.025.485.895.756.30非极性氨基酸（8种）丙氨酸1.

编码氨基酸2.

非编码氨基酸

没有相应的三联体遗传密码。由编码氨基酸经羟基化、甲基化、磷酸化等修饰形成的衍生物。例如：胶原蛋白和弹性蛋白中的4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。3.非蛋白质氨基酸

在生物体内，还发现150多种不参与蛋白质组成的氨基酸。这些非蛋白质氨基酸多是重要的代谢物前体或代谢中间产物。氨基酸分类（1）根据R基团的结构和性质分类:结构特点：脂肪族、芳香族、杂环族等氨基酸、带苯环的、有羟基的、含S的等等性质特点：疏水性（非极性）、亲水性（极性）氨基酸，酸性、碱性等氨基酸）（2）丛营养学角度分类:

必需氨基酸、非必需氨基酸1.两性性质和等电点氨基酸同时含有氨基和羧基三.氨基酸的理化性质以中性氨基酸为例，当溶液的pH由低到高时：等电点pI是氨基酸的特征常数1.两性性质和等电点

等电点(isoelectricpoint)20种氨基酸的pI氨基酸pI氨基酸pI氨基酸pI氨基酸pIAla6.02Pro6.48Thr5.87Asp2.77Val5.97Phe5.48Cys5.07Glu3.22Leu5.98Trp5.89Tyr5.66Lys9.74Ile6.02Gly5.97Asn5.41Arg10.76Met5.74Ser5.68Gln5.65His7.591.两性性质和等电点

等电点的计算例Gly

的pI

计算－H+＋H+NH2—CH2

—COO－Gly

－＋NH3—CH2

—COO－Gly

±

＋NH3—CH2

—COOHGly

＋pI=1/2(pK1'+pK2')－H+＋H+K1'K2'K1'、K2'分别代表

COOH和NH3＋的表观解离常数。1.两性性质和等电点等电点的计算例Lys

的pI

计算pI=1/2(pK2'+pK3')溶液pH值增大COOHCH－NH3(CH2)4NH3＋＋Lys

＋＋CH－NH2COO－(CH2)4NH2Lys

－COO－CH－NH3(CH2)4NH3＋＋Lys

＋－H+＋H+Lys

±COO－CH－NH2(CH2)4NH3＋－H+＋H+－H+＋H+K1'K2'KR'1.两性性质和等电点等电点的计算

Glu

的解离1.两性性质和等电点等电点的计算pI=1/2(pK1'+pK2')中性氨基酸pI=1/2(pK2'+pKR')pI=1/2(pK1'+pKR')碱性氨基酸酸性氨基酸1.两性性质和等电点等电点的计算ConclusionpH>pI

带负电，移向正极pH<pI

带正电，移向负极pH=

pI

不带电，不移动2.光学性质除Gly之外，其余蛋白质氨基酸都有手性碳原子，都具有旋光性。旋光性质三.

氨基酸的理化性质2.光学性质Trp、Tyr、Phe

含芳香环共轭双键系统，最大吸收峰分别在279nm、278nm、259nm。紫外吸收3.重要的化学性质a,茚三酮反应还原性茚三酮OOOHH＋NH3＋CO2＋RCHO水合茚三酮＋RCH－COOHNH2OOO＋2NH3＋OOOHHOOOO＋NH4NO＋3H2O蓝紫色化合物OO反应分2步：茚三酮反应常用于aa的定性和定量分析还原性茚三酮水合茚三酮

纸层析分开各种氨基酸后定性定量分析3.重要的化学性质茚三酮反应在酸性条件下，氨基酸与茚三酮共热，生成紫色化合物注意:

若是亚氨基酸，生成黄色化合物

3.重要的化学性质b,Sanger反应在弱碱溶液中，氨基酸的α-氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB)

反应，生成黄色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA）。DNFB＋O2NNO2FH2NCHCOOHR

DNP-氨基酸O2NNO2HNCHCOOHR＋HF此反应最初被Sanger用于测定肽链N-端氨基酸3.重要的化学性质c,Edman反应NCS＋40℃，弱碱NCNHRCHCOS40℃，H+、硝基甲烷H2NCHCOOHRPITC异硫氰酸苯酯

PTC-氨基酸苯氨基硫甲酰氨基酸

PTH-氨基酸苯硫乙内酰脲氨基酸HNCNHRCHCOOHS可用层析法鉴定出aa的种类3.重要的化学性质Edman反应此反应即是目前“蛋白质顺序测定”的设计原理三.蛋白质的结构1、肽键及肽2、酰胺平面3、蛋白质结构层次一级结构；二级结构；结构域；超二级结构；三级结构；四级结构1.肽和肽键

肽由氨基酸构成的线形聚合物称为肽（peptide）。二个氨基酸分子缩合而成的肽，称为二肽（dipeptide）。NHαCOCαNHαCOCOHHHR1R2H肽的结构

1、中文表示法：

从肽链的N端开始，对氨基酸残基逐一命名，残基称氨酰

肽的表示法2、三字母表示法：

aa1-aa2-aa3-aa4-……aa1.aa2.aa3.aa4.……

3、单字母表示法：

ABCD……

规定：以自由的-NH2端，即N-端作为开头以自由的-COOH端，即C-端作为结尾如：Tyr-Gly-Gly-Phe-Met（YGGFM）酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰蛋氨酸反过来写：Met-Phe-Gly-Gly-Tyr是一个不同的五肽肽的性质其等电点是在所有可解离的基团的净电荷为0时的pH。肽链的一端含有一个游离的

-氨基，另一端含有一个游离的

-羧基，加上部分氨基酸可解离的R基团，因而与氨基酸一样具有两性解质的性质。（1）两性性质茚三酮反应（2）化学性质

Sanger反应氨基酸也有Edman

反应双缩脲反应——肽和蛋白所特有的，氨基酸不发生双缩脲反应重要的天然寡肽NCOHCH2CH2CHHOOCNH2NCOHCHCH2SHCOOHCH2γ—谷氨酰半胱氨酰甘氨酸Cys

残基上的-SH是GSH的活性基团。1、谷胱甘肽（GSH）：由Glu-Cys-Gly组成的三肽Glu-Cys-GlyGlu-Cys-GlySS重要的天然寡肽谷胱甘肽在生物体内的功能：a,参与氧化还原反应b,保护巯基酶类的活性c,防止H2O2等在生物体内的积累2GSH==GS-SG酰胺平面——由肽键周围的6个原子组成的刚性平面—C—NH—OOCa—CN—CaH键长介于单双键之间O–—CNH—+2、酰胺平面肽键虽是单键却有双键性质，是一种中间态，即具有部分双键性质周边六个原子在同一平面上前后两个a-carbon在对角CNCHaNCOCa0.123nm0.132nm0.153nm0.147nmC-N0.149nmC=N0.127nm肽键肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。可将肽链的主链看成是由被Ca隔开的许多平面组成的。N端C端RHHOCCaNCaCRONOCNCaCRONCaHHHHCaH酰胺平面IICa-C和Ca-N之间可以自由旋转：两个相邻酰胺平面绕Ca的旋转酰胺平面ICaCaCaCCHOONNRHHfy

由于Ca-C和Ca-N之间可以自由旋转，所以构成了主链的延伸趋向。两个相邻酰胺平面绕Ca的旋转酰胺平面蛋白质结构层次

（一）蛋白质的一级结构概念：多肽链上各种氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸序列称为蛋白质的一级结构（primarystructure）。（51Aa，5733u）

构型（configuration）是指不对称碳原子上相连的各原子或取代基团的空间排布（D-构型、L-构型）构型的改变伴随着共价键的断裂和重新形成构型和构象

构象（conformation）是指相同构型的化合物中，与碳原子相连的各原子或取代基团在单键旋转时形成的相对空间排布。

构象的改变不需要共价键的断裂和重新形成，只涉及氢键等次级键的改变。蛋白质的二级结构是指多肽链本身通过氢键作用折叠、盘绕而形成的构象单元。1、二级结构的概念天然蛋白质二级结构包括

α-螺旋(a-helix)

β-折叠(b-sheet)

β-转角(b-turn)

无规则卷曲(nonregularcoil)等等（二）蛋白质的二级结构a）α-螺旋结构参数

螺距=0.54nm/圈

3.6个AA/圈

100°/AA0.15nm/AAα-螺旋结构的主要特点：（1）α-螺旋(α-helix)（Pauling）2、二级结构单元的种类蛋白质中最常见、含量最丰富的二级结构b）绝大多数天然蛋白质α-螺旋都是右手螺旋。每个氨基酸残基的N-H都与前面第四个残基C=O形成氢键。α-螺旋也称3.613-螺旋c）肽链上所有的肽键都参与氢键的形成，氢键几乎平行于中心轴;

螺旋体中所有氨基酸残基侧链（R-基团）都伸向外侧

RRRRRRRRR螺旋的横截面**R为Gly时，由于Ca上有2个氢，使Ca-C、Ca-N的转动的自由度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大大降低；而多聚亮氨酸侧链R基较大，产生空间位阻，影响螺旋形成*α-螺旋遇到Pro就会被中断而拐弯，因为脯氨酸是亚氨基酸。

*带相同电荷的氨基酸残基连续出现在肽链上时，螺旋的稳定性降低。d)螺旋稳定性由氨基酸序列决定(2)、β-折叠(β-sheet)（Pauling)

β-折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结而成的锯齿状片状结构。

侧链基团与Cα间的键几乎垂直于折叠平面，R基团交替地分布于片层平面两侧。

β-折叠分平行式和反平行式，后者更为稳定。N端在同一端。氨基酸之间沿轴相距0.325nmN端不在同一端。氨基酸之间沿轴相距0.35nm(2)β-折叠(β-pleatedsheet)

维持β-折叠结构稳定性的力——氢键由一条链上的羰基和另一条链上的氨基之间形成，即氢键是在链与链之间形成的。二.蛋白质的二级结构(3)β-转角（β-turn）也称β-回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回折180°，使得氨基酸残基的C=O和与第四个残基的N-H形成氢键。甘氨酸和脯氨酸经常出现在β-转角中

β-转角都在蛋白质分子的表面。二.蛋白质的二级结构（3）β-转角（β-turn）N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHOβ-转角经常出现在连接反平行β-折叠片的端头。(4)、无规则卷曲（non-regularcoil）

又称自由卷曲、自由回转，是指没有一定规律的结构,本身有一定稳定性。酶的功能部位常常处于这种构象区域无规卷曲常出现在a-螺旋与a-螺旋、a-螺旋与β-折叠、β-折叠与β-折叠之间。它是形成蛋白质三级结构所必需的。注意:无规卷曲与蛋白质变性后的无规则线形结构不同二级结构单元的种类3、超二级结构（Supersecondarystructure）定义指多肽链上若干相邻的二级结构单位(即单个

-螺旋或-转角)彼此作用，组合成有规则的结构组合体。类型

-由两股或三股右手螺旋缭绕而成的左手螺旋

-由两股折叠片，中间加入螺旋而形成的结构

-由三条或更多的反平行式-链通过-转角或其它的肽段连接而成的结构4.结构域(domain)

指在二级结构或超二级结构的基础上，多肽链进一步折叠成几个相对独立，近似球形的组装体，可作为三级结构的局部折叠区。结构域在空间上可以辨认.对于有几个结构域的蛋白质分子:A结构域之间往往有一段肽链相连—铰链区,结构域之间可以相对运动,有利于活性中心的形成,活性中心一般在结构域的交界处B各个结构域可以相似或不相似

三级结构（tertiarystructure）：指的是多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步折叠卷曲形成特定的构象。鲸肌红蛋白的三级结构5、三级结构的概念三级结构与结构域如果一条多肽链只形成一个结构域,那这个结构域就是三级结构

如果一条多肽链形成两个或两个以上结构域,那这几个结构域总称为三级结构球状蛋白的三级的结构特点分子表面往往有一个内陷的空隙，它常常是蛋白质的活性中心肽链盘绕成紧密的球状结构大多数非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核；而极性侧链在分子表面，形成亲水面6、四级结构

四级结构（quaternarystructure）：由两条或两条以上具有三级结构的多肽链聚合而成、有特定三维结构的蛋白质构象。每条多肽链又称为亚基。

亚基一般是一条多肽链,

有时是二硫键连接的几条多肽链由两个或多个亚基构成的蛋白质,称为寡聚蛋白质,寡聚蛋白质的亚基可以相同,也可以不相同,

单亚基蛋白质无四级结构例如，血红蛋白的四级结构两个亚基的结构其中二硫键和疏水作用最主要（一）维持构象的作用力7.维持蛋白质构象的作用力共价键次级键化学键肽键一级结构氢键二硫键二、三、四级结构疏水键离子键范德华力三、四级结构蛋白质分子中的共价键与次级键7.维持蛋白质构象的作用力四蛋白质结构与功能的关系（一）一级结构与功能的关系（二）空间结构与功能的关系蛋白质的空间结构是指蛋白质的二级、三级和四级结构（一）一级结构与功能的关系

1、一级结构变异与分子病

由于基因突变导致蛋白质一级结构发生变异，使蛋白质的生物功能减退或丧失，甚至造成生理功能的变化而引起的疾病。分子病镰刀型红细胞贫血病（sick-cellanemia）

？正常红细胞和镰刀状红细胞的扫描电镜图谱镰刀型红细胞贫血病(sickle-cellanemia)β-链12345678Hb-AH2N-

Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-SH2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…

hemoglobinGAA(Glu)

->GTA(Val)

Val取代Glu含氧-HbAO2O2粘性疏水斑点含氧HbS脱氧HbS疏水位点血红蛋白分子凝集

2、氨基酸组成变化改变其功能（一）一级结构与功能的关系

（一）一级结构与功能的关系

3、一级结构变异与生物进化不同生物与人的细胞色素C相比较AA差异数目

黑猩猩0鸡、火鸡13

牛猪羊10海龟15

狗驴11小麦35

粗糙链孢霉43酵母菌44亲缘关系越近，AA顺序的相似性越大。CytC

高级结构的保守性（一）一级结构与功能的关系

3、一级结构变异与生物进化尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处（一）一级结构与功能的关系

3、一级结构变异与生物进化不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质，它们的氨基酸序列有明显的相似性，有明显序列相似性的蛋白质，称为同源蛋白质。不变残基----同源蛋白质完全相同的氨基酸残基，决定蛋白质的空间结构与功能。可变残基----有相当大变化的氨基酸残基，体现了种属特异性。

可变残基与生物进化有关，亲缘关系越近，可变残基越相似，说明蛋白质的进化反应了生物进化（一）一级结构与功能的关系

许多蛋白质，如酶蛋白、激素蛋白等，它们在体内常以无活性的前体存在，在一定情况下经体内的蛋白酶水解，切去部分肽段后，才变成有活性的蛋白质4、一级结构与蛋白质前体的激活前体胰岛素（84AA）

A链（21AA）

B链（30AA）

C链（33AA）

活性胰岛素猪胰岛素原激活成形成胰岛素示意图一级结构是蛋白质结构的基础蛋白质一级结构决定其特定的高级结构

生物功能的体现更与蛋白质分子特定的空间结构（构象）相关（二）空间结构与功能的关系

1，蛋白质的变性与复性

变性（denaturation）是指一些理化因素破坏了蛋白质的空间结构，结果导致其生物活性的丧失。变性有时是可逆的。消除变性的因素，有些蛋白质的生物活性可能得以恢复，称为复性（renaturation）。天然状态有活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态无活性牛胰核糖核酸酶（RNase）的变性与复性因此，人们认为，蛋白质中的A.A.顺序包含了其高级结构（构象）形成的全部信息

RNase是由124氨基酸残基组成的单肽链，分子中

8个Cys的-SH构成4对二硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质分子。在蛋白质变性剂（如8mol/L的尿素）和一些还原剂（如巯基乙醇）存在下，酶分子中的二硫键全部被还原，酶的空间结构破坏，肽链完全伸展，酶的催化活性完全丧失。当用透析的方法除去变性剂和巯基乙醇后，发现酶大部分活性恢复，所有的二硫键准确无误地恢复原来状态。若用其他的方法改变分子中二硫键的配对方式，酶完全丧失活性。这个实验表明，蛋白质的一级结构决定它的空间结构，而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证。2、朊病毒与蛋白质构象病朊病毒蛋白（prionprotein,PrP）是正常存在于人体神经原、神经胶质细胞等多种细胞的细胞膜上的糖蛋白。朊病毒（prion,PrPsc）是正常朊病毒蛋白（PrPc）的空间构象由

螺旋变成

折叠所致，因此，这类疾病又称蛋白质构象病。

（二）空间结构与功能的关系

正常朊病毒蛋白与朊病毒空间结构的差异朊病毒本身不能复制，但它却可以攻击大脑的正常朊病毒蛋白，使其发生构象改变，并与其结合，成为致病的朊病毒二聚体。此二聚体再攻击正常的朊病毒蛋白。这样，脑组织中的朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生退行性变。正常朊病毒蛋白结构（显示

-螺旋）朊病毒结构（显示

-片层结构）

3、血红蛋白的别构效应（二）空间结构与功能的关系

血红蛋白的α、ß链与肌红蛋白，三级结构几乎完全相同，都有一个血红素分子，可以结合一分子氧O2HbHb-O2O2血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线活动肌肉毛细血管中的PO2020406080100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin血红蛋白输氧功能和构象变化别构效应S形曲线双曲线一个亚基与氧结合后，三级结构改变，使其它亚基发生三级结构的变化，亚基间盐键断裂，紧密的分子结构变松弛，大大加快氧合速率，从而曲线程S形。

酶活性中心大多位于结构域的界面之间，在酶实施有关生物功能时，必定伴随着结构域的相对运动。如酵母己糖激酶的催化作用中，存在着开放型和闭合型二种构象的转换。蛋白质功能的体现与结构域运动相关（二）空间结构与功能的关系

葡萄糖与已糖激酶结合时的构象变化结合前结合后

ATP合酶中的γ-亚基单向旋转是其催化ATP合成反应进行所必须（Noji等，1997）蛋白质亚基的运动与其生物功能的体现

α

γ

βγ亚基旋转，引起β亚基构象周期性变化，将ADP和Pi加合形成ATP

结论：

决定运动一级结构-------→空间结构-----→特定构象---

（不完全自发）（精确性）

-----------→生物功能体现一级结构空间结构功能决定一致性间接蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。结构预测功能预测定点突变改造蛋白质从头设计构建新的蛋白质我们可以做什么？蛋白质工程是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。或者从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造天然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以制造新型的蛋白质。五蛋白质的性质1.蛋白质的酸碱性与等电点酸碱性：α－氨基与α－羧基；侧链基团如ε－氨基、β－或γ－羧基、咪唑基、胍基、巯基等。可用电泳技术研究。等电点：PI时蛋白质溶解度最小。2.蛋白质的胶体性质（1）胶体溶液性质：布朗运动、电泳现象、不能透过半透膜、具有吸附能力等。（2）蛋白质胶体溶液的稳定性及意义：水化膜与带有相同电荷；（3）透析法：分离的分子量杂质与蛋白质。（4）沉淀反应（4）沉淀反应：a.中性盐沉淀反应:盐浓度不同可产生不同的反应－－盐溶与盐析现象；分级沉淀；盐析法得到的蛋白质不变性。b.有机溶剂沉淀反应：与水互溶的有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等。注意容易引起蛋白质变性。c.重金属盐沉淀反应：蛋白质带负电时，可与重金属离子（Cu、Hg、Pb、Ag）结合成不溶性的蛋白盐而沉淀。d.生物碱试剂的沉淀反应：生物碱试剂如单宁酸、苦味酸等。

3.蛋白质的变性（1）定义：当蛋白质受到物理、化学因素影响后，分子的三维结构发生改变，而一级结构并没有破坏，此时蛋白质失去了原有的生物活性，并伴随着物理、化学性质的改变。分为可逆与不可逆变性。（2）变性蛋白性质的改变：

生物活性丧失一些侧链基团暴露某些理化性质改变生物化学性质改变（3）变性的应用（4）变性与沉淀（5）复性4.蛋白质呈色反应1，下列氨基酸中，[a]TD=0的是:AGlnBGluCGlyDIle(2009)2，由360个氨基酸残基形成的典型α螺旋，其螺旋长度是A.54nmB.36nmC.34nmD.15nm(2008)简述蛋白质的一级结构及其与生物进化的关系。(2008)酶纯化实验中，通常先用（NH4）2SO4作为分级沉淀剂，再用SephadexG-25凝胶柱层析法从沉淀酶液中除去（NH4）2SO4。请问：（1）与其他中性盐沉淀剂相比，用（NH4）2SO4做沉淀剂有何优点（2）如发现柱层析后酶的总活性较纯化前明显升高，可能的原因是什么？（3）柱层析时，湿法装柱的注意事项主要有哪些？请写出凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理，并简单说明在蛋白样品中加入一定量的三聚氰胺（分子式C3H6N6）为什么会导致样品测定值高于实际值的原因。（9分）1.蛋白质在波长为

nm的紫外光中有明显的吸收峰，这是由

、

和

三种氨基酸残基所引起的。

2.Glu的pK1(a-COOH)=2.19、pK2(R基团)=4.25、pK3(a-NH3+)=9.67，该氨基酸的pI值为

。3.有一混合蛋白样品，含A、B、C、D四种蛋白质，其pI分别为4.9、5.2、6.6和7.8，若将此样品液置于pH7.0的缓冲液中电泳，向负极移动的有

。

4.在组成蛋白质的二十种氨基酸中，

是亚氨基酸，当它在a-螺旋行进中出现时，可使螺旋

。5.Lys的a-COOH、a-NH3+的pK值分别为2.18和8.95，该氨基酸的pI值为9.74，则R基团的pK值为

，它是由

基团的解离引起的。6,

某蛋白质的某一区段含有15个氨基酸残基，这些残基之间均可形成如下图所示的氢键。(1)该区段具有

的二级结构，它的长度为

纳米。(2)该区段的主链中可形成

个氢键。(3)已知该区段被包埋在整个蛋白质分子的内部，则这一区段很可能含有较多的

氨基酸。

二、选择题1.在下列肽链主干原子排列中，哪个符合肽键的结构

(A)C－N－N－C(B)C－C－C－N(C)N－C－C－C

(D)C－C－N－C(E)C－O－C－N2.下列什么氨基酸溶液不使偏振光发生旋转

(A)Ala(B)Gly(C)Leu(D)Ser(E)Val3.下列AA中，蛋白质内所没有的是

(A)高半胱氨酸(B)半胱氨酸

(C)鸟氨酸(D)胍氨酸4.蛋白质变性不包括

(A)肽链断裂(B)离子键断裂

(C)疏水键断裂(D)氢键断裂5.下列氨基酸中，在波长280nm处紫外吸收值最高的氨基酸是

(A)Lys(B)Cys(C)Thr(D)Trp6.维持蛋白质二级结构的作用力是肽键(B)离子键(C)疏水键(D)氢键(E)二硫键7.蛋白质肽链在形成

-螺旋时，遇到Pro残基时，

-螺旋就会中断而拐弯，主要是因为，没有多余的氢形成氢键(B)不能形成所需的

角(C)R基团电荷不合适(D)整个

-螺旋不稳定8.蛋白质的空间构象主要取决于下列哪项（）

A.多肽链中的氨基酸排列顺序 B.次级键 C.链内及链间的二硫键 D.温度及pH9.加入哪种试剂不会导致蛋白质变性（）

A.尿素 B.盐酸胍 C.SDS D.硫酸铵 E.二氧化汞10.下列哪种氨基酸在生理pH范围内具有缓冲能力（）A.赖氨酸 B.谷氨酸 C.丝氨酸 D.组氨酸 E.苏氨酸蛋白质有哪些重要的功能生物催化、结构蛋白、运输功能、收缩功能、激素功能、免疫保护功能、贮藏蛋白、接受和传递信息、控制生长和分化、毒蛋白下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中：

CNBr②异硫氰酸苯酯③丹磺酰氯④脲⑤6mol/L的盐酸⑥β-巯基乙醇⑦水合茚三酮其中哪一个最适合完成以下各项任务1、测定小肽的氨基酸序列。2、测定肽的氨基末端残基。3、不含二硫键的蛋白质的可逆变性。若有二硫键存在时还需加什么试剂？（1）异硫氰酸苯酯（2）丹磺酰氯（3）脲，β-巯基乙醇还原二硫键

胃液pH1.5的胃蛋白酶的等电点约为1.远比其他蛋白质低。试问等电点如此低的胃蛋白酶必须存在大量的什么样的官能团，什么样的氨基酸能提供这样的基团？

-COO-；Asp,Glu简述甘氨酸的特点及其在蛋白质结构中的作用？甘氨酸的特点是侧链R基团很小，在α-螺旋中任取二面角，破坏α-螺旋；在β-折叠中，时片层紧密而稳定。甘氨酸小且具