棉花品种真实性鉴定 SSR 分子标记法

附件3：

ICS:

ICS

B21

NY

中华人民共和国农业行业标准

NY/T

棉花品种真实性鉴定SSR分子标记法

SSR-basedmethodsforvarietygenuinenesstestingof

Gossypiumspp

（征求意见稿）

××××-××-××发布××××-××-××实施

中华人民共和国农业农村部发布

[键入文字]

目次

1范围1

2规范性引用文件1

3术语、定义和缩略语1

4总则错误！未定义书签。

5检测方案2

6仪器设备、试剂和溶液配制5

7真实性检测程序6

8结果计算与表示9

9结果报告10

附录A（规范性附录）溶液配制11

附录B（规范性附录）等位变异扩增片段信息13

附录C（资料性附录）引物分组信息19

附录D（资料性附录）参照样品名单20

I

[键入文字]

前言

本标准依据GB/T1.1-2009给出的规则起草。

请注意本标准的某些内容有可能涉及专利。本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。

本标准由中华人民共和国农业农村部种业管理司提出。

本标准由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC37)归口。

本标准起草单位：

本标准主要起草人：

II

棉花品种真实性鉴定SSR分子标记法

1范围

本标准规定了利用SSR分子标记法进行棉花(Gossypiumspp)品种真实性检测的原则、检测方案、检

测程序和结果报告。

本标准适用于陆地棉（G.hirsutum）和海岛棉（G.barbadense）品种真实性验证和品种真实性身份

鉴定，不适用于实质性派生品种（EDV）的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本

文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.1农作物种子检验规程总则

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语、定义和缩略语

3.1术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1.1品种真实性验证varietyverification

与其对应品种名称的标准样品比较，检测证实供检样品品种名称与标注是否相符。

3.1.2品种真实性身份鉴定varietyidentification

经分子技术检测并通过相应品种指纹数据比对平台筛查比较，确定供检样品的真实品种名称。

3.1.3标准样品standardsample

国家指定机构保存的代表品种特征特性的实物样品或DNA样品。

3.1.4SSR指纹数据比对平台SSRfingerprintblastplatform

采用SSR标记的标准化方法对品种标准样品的等位变异进行检测，并运用计算机数据库技术和网

络信息技术所构建的审定品种分子数据信息的检索比对载体。

3.1.5参照样品referencecontrolsample

具有SSR位点上主要等位变异的品种，用于辅助确定试验样品的等位变异，校正仪器设备的系统

误差。

3.1.6引物primer

一条互补结合在模板DNA链上的短单链，能提供3’-OH末端作为DNA合成的起始点，延伸合成模

板DNA的互补链。

3.1.7组合引物panel

具有不同荧光颜色或相同荧光颜色而扩增片段大小不同、能够组合在一起进行电泳的一组荧光标

记引物。

3.2缩略语

下列缩略语适用于本标准。

bp:碱基对（basepair）

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide）

DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis）

PCR:聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

SSR:简单重复序列（simplesequencerepeat）

Taq酶:耐热DNA聚合酶（Taq-DNApolymerase）

4原理

棉花不同品种的基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列(SSR)的重复次数差异。这种差

异可以通过从有代表性的供检样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳检测出来，因此可以利

用扩增片段大小不同区分品种。

依据SSR标记检测原理，采用SSR引物，通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平台比对的

方式，对品种真实性进行验证或身份鉴定。真实性验证依据SSR位点差异数目而判定，品种真实性

身份鉴定依据被检SSR位点无差异原则进行筛查和鉴定。

5检测方案

5.1总则

对于真实性鉴定，引物、检测平台、样品状况不同，其检测结果的准确度、精确度可能有所不同。

应依据“适于检测目的”的原则，统筹考虑检测规模和检测能力，择定适宜的检测平台、样品状况，制

定相应的检测方案。

在严格控制条件下，合成选择的引物，按照确定的检测平台对供检样品按DNA提取、PCR扩增、

电泳、数据分析的程序进行检测。

按规定要求填报检测结果，检验报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息。

DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求，在适于检测目的和不影响检测质量的前提下，按照

检测平台的要求，允许对本标准的规定做适当调整。

5.2检测平台

5.2.1品种真实性验证可采用变性PAGE垂直板电泳或者毛细管电泳，宜在同一电泳板上比较试验样品

和标准样品，亦可与标准样品指纹比对；真实性身份鉴定，宜采用毛细管电泳。利用SSR指纹数据比

对平台进行鉴定。

5.2.2对于试验样品数量较多的，可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增

仪、DNA分析仪进行组合，以提高检测的综合效率。

5.3引物

5.3.1本标准遴选了60对SSR引物作为品种真实性验证和身份鉴定的检测引物，具体见表1。

表1引物信息

引物染色体退火温度

编号引物序列（5’—3’）

名称（编号）（℃）

正向：CCACCAGCCTTACCTTATACGC

PC01CCRI0011A60反向：GTGCTTGGCCTCGCTAAGTG

正向：AGTCCTCCCACTATTCGAAGCT

PC02CCRI0022A60反向：ATGCCTCGTACCCTGTTCCG

正向：CACGACGACTCTTCCTCATCAC

PC03CCRI0033A60反向：ATTGCAGCCACGAAATTGTCAC

正向：AGGCTCGCATTGTTGACACTAGG

PC04CCRI0044A60反向：CGAGCTTGAACGAACGAACCTCT

正向：TCGATTCACCGATCTGACAAGC

PC05CCRI0055A60反向：TGACCCAGACCGACCGTTG

正向：ACCAGGTCGGTAACGATAGGC

PC06CCRI0066A60反向：GCCCAAAGTTGAAGCGGAAAAC

正向：GTATGTCCAATCGCCACCCTAG

PC07CCRI0076A60反向：GATGACGGTGTTAGGCGGTTC

正向：GGCCTCCCATCTTTATCCAATGT

PC08CCRI0087A60反向：AGCAAAGCAAACTCGACAATGCT

正向：TTGGGCGGTTTGGGTCAAGG

PC09CCRI0098A60反向：GGGATTCGGTCGGACACTCAAG

正向：GCCGGTAAGTCCAACATAAGGG

PC10CCRI0109A60反向：CGGGGTAGTCCACCTCCTATTG

正向：ACTACGCAACTGAAGGGTTTCG

PC11CCRI01110A60反向：GCTGCAAGGTTCGATGGAAGTG

正向：CTGCCTCGACCTACAGTTTGAC

PC12CCRI01211A60反向：AGTTTTAGGCGGTTTGGGTTTG

正向：ACCATCCTTGCCGAGTAACCTG

PC13CCRI01312A60反向：GTTGATGCCTGGGTCTCAATGC

正向：AGACGTGAGTTCGAGGACTTTG

PC14CCRI01412A60反向：GCCTACCCTCTCAACAGTTTGG

正向：TTTCACTTGTCCGACCTTACCC

PC15CCRI01513A60反向：GGATATGTGTTTGAGCGTGCTG

正向：CGAAAGAGTGTCGAGCAATCCG

PC16CCRI0161D60反向：TCCTGTCAACTTGGAGGCTGAG

正向：CGCCACATGACCCCACCATC

PC17CCRI0172D60反向：CCCACCGAGTATACAGGACACG

正向：CCGCTCGGTTCAACAGGTTT

PC18CCRI0183D60反向：AGAGTTTGCGGTTTTGGTGCC

正向：CCAGCCACTCGGAGATCCTTG

PC19CCRI0193D60反向：GCGTGGAGAAACCAGAGGGTAG

正向：ACCACTTTGTCCACCTGTCCAC

PC20CCRI0204D60反向：ATCATCGCCATCTGCCTGGAAG

正向：AATTGAACCAAGGGCATCATGC

PC21CCRI0215D60反向：GAACCTGATTGACGGGTAGCAC

正向：TGATGTTGGCGGGACTATGTAG

PC22CCRI0226D60反向：CGACTTCACCCTCGTGGTAATC

正向：CTTCCCCACGCCACTACTATCG

PC23CCRI0237D60反向：CTCAGCTTTCCTCCTCATTGGC

正向：ACGAGGGAACATGTGATCTCCT

PC24CCRI0247D60反向：TCACTCCAAATCACACGTGCCA

正向：ACCAGCATCCTTTGTGTTAGGC

PC25CCRI0258D60反向：GGATCGATTTTGGAACCGTGTG

正向：TTCCATGAGGCTATCCACAAGC

PC26CCRI02610D60反向：AATGCACCGCACCCCATCAC

正向：GCGGGCCACCTAATGATGATTG

PC27CCRI02711D60反向：TTGTTTGACGAGGGAGACGATC

正向：ACAAGCGCGTCTGCCATATCC

PC28CCRI02811D60反向：CGTGGTGGGTAGTCACAGTCAG

正向：ACACTGATGTGGCATCGACTAG

PC29CCRI02912D60反向：GAATCTGGGCAAACTGTTGTCC

正向：GCCGAGGCCCCTATAACCC

PC30CCRI03013D60反向：CTCATATCACGCACCACACCAC

正向：CCGGTTCAAGCCGACTATTCG

PC31CCRI0311A60反向：ACTCGTAACACCGTGCTGATTG

正向：CTGAGGAGAAAGACAGGACGAC

PC32CCRI0321A60反向：TGGCGGGGTAAATGTGAATGC

正向：TGGGTGAGTGTGAGGACTGAAG

PC33CCRI0333A60反向：TGGGTGTTGCACAAAGTTTCTG

正向：GTGGGCAGCGATGAATATGATG

PC34CCRI0343A60反向：ATGAGGGTCATTGCTTGGGTTG

正向：GCCGTTTCTGCCAACCCCTT

PC35CCRI0354A60反向：CGGGATTCCACGTGCCCAAA

正向：CGTCTCGTCCCACCTGTAATGC

PC36CCRI0365A60反向：GGACTTCGGCAAGGCGGTTC

正向：TTCCTGCAAAATTGCCTTCACC

PC37CCRI0377A60反向：TGCTTTGATATCCCCGTGATGG

正向：AGGGACAAGAATGGACCGACAG

PC38CCRI0387A60反向：TTAACCGTCGCAGCCTCCTAAC

正向：TGCCCTTCTTGCCCCTGTG

PC39CCRI0398A60反向：GCTTGCCTAATTTGGTGGGAAG

正向：TTACTCTGGGCGTGTGGCATAG

PC40CCRI0409A60反向：ATGGAAGGAACAGCAGCAAACG

正向：TGTGGCTCCATGGCACAATATG

PC41CCRI04110A60反向：AGGCTCTGTTGCACCAATTCAC

正向：GTTGGAGGCTGCTTTTGATGGG

PC42CCRI04211A60反向：TGCCATTGCCATGTTGGTCAAG

正向：GGACAAACATGGCCCCAACT

PC43CCRI04311A60反向：TGTCCAAACTCTTGCCAACTTGT

正向：TCTTAGGGCACAATGAGGCAAGA

PC44CCRI04412A60反向：CTAAGCAGCACCTCATCCAGAAA

正向：AACTCAATGGGTGTCGGTTACG

PC45CCRI04513A60反向：GGAGGTGAGCTATCTTCGCAAC

正向：AGCACGGAAGAACATGATGAGG

PC46CCRI04613A60反向：CGTCTTCGGCTCAAATGTGTGC

正向：TGCCCAACCTACATGTGACACA

PC47CCRI0471D60反向：TCAAATTTGGTTGTCACACCCCA

正向：CCACATGCCACGCCGTATTATG

PC48CCRI0481D60反向：ATGATGGGGTGGGCTGTAAAGG

正向：TTGGGCCGAAAAGGGTTGAAAC

PC49CCRI0492D60反向：GGTCGGATTCTGGGCACTTTTC

正向：AGTTCGGTGGACATCAATAGGC

PC50CCRI0502D60反向：TCCCCAGGGCTTTGAGAATACC

正向：CGCCACATCCAAGGGTGAATG

PC51CCRI0514D60反向：GGAATTGCGGTCCCAATACCAC

正向：ATTCATGGTCAAGTCGGGTCAC

PC52CCRI0525D60反向：GCTTGCTTTGGGTGGAGTAGAC

正向：GTTGCTGTGGAGTGGAGTGGAG

PC53CCRI0535D60反向：TTCGAGGGAGGTTGGTATTGGC

正向：TGGCTTTGCTTTGCTTATGGTGA

PC54CCRI0546D60反向：TGCACTCAACTGGACACACTTT

正向：AATTGTGGAGGGGCACTGTCAG

PC55CCRI0557D60反向：GTCCCCGCCATCCAAGCAC

正向：GACTCATGGCGACAGCGATTAG

PC56CCRI0568D60反向：TGATCACTCAAACGGTGTCACG

正向：GTTTCCACCGTCGAACCACTG

PC57CCRI05710D60反向：GGCAGGATTAGGAGATCGAAGC

正向：TCAGGGGCTCCGTCGTTCTC

PC58CCRI05810D60反向：CTCGGCTCTTTCTCCGGTTGC

正向：AGTACCCCTATTTTCCCGTGAGA

PC59CCRI05912D60反向：TGGGTCTCACATGTGGATTGTTG

正向：GGAAATGGCCCATCTGAGAGTC

PC60CCRI06013D60反向：GCCAGGAGATCGGAGCGTTTG

注：本表中60对引物均为中国农业科学院棉花研究所通过基因组重测序自主开发遴选。

5.3.2品种真实性身份鉴定可采用序贯方式，也可直接采用表1的60对SSR引物进行检测，经比较后仍

与已知品种没有位点差异而无法得出结论的，允许采用其它能够区分的分子标记进行检测。

5.3.2品种真实性鉴定采用表160对SSR引物构建试验样品指纹，与SSR指纹数据比对平台比较筛查与试

验样品指纹一致的品种。

5.4样品

5.4.1送验样品种子重量应不低于50g或不少于500粒；送验样品为棉铃、幼苗、叶片等组织或器官，

数量应不低于70个（分别来自不同个体）。

6.4.2从送验样品中分取有代表性的试样，采用混合样或单个个体进行检测。混合样试来源应至少含有

70个个体，单个个体试样应至少含有30个个体。

5.5检测条件

真实性鉴定应在有利于检测正确实施的控制条件下进行，包括但不限于下列条件：

——种子检验员熟悉所使用检测技术的知识和技能；

——所有仪器与使用的技术相匹配，并已经过定期维护、验证和校准；

——使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材；

——使用校准检测结果评定的适宜参照品种。

6仪器设备、试剂和溶液配制

6.1仪器设备

6.1.1DNA提取

高速冷冻离心机、水浴锅或干式恒温金属浴、紫外分光光度计或核酸浓度测定仪、组织研磨仪。

6.1.2PCR扩增

PCR扩增仪或水浴PCR扩增装置。

6.1.3电泳

6.1.3.1毛细管电泳

基因测序仪。

6.1.3.2变性PAGE垂直板电泳

高压电泳仪、垂直板电泳槽及制胶附件、胶片观察灯、凝胶成像系统或数码相机。

6.1.3.3其它器具

微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、加热磁力搅拌器、冰箱、染色盒。

6.2试剂

6.2.1DNA提取

CTAB、SDS、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O）、三羟

甲基氨基甲烷（Tris-base）、盐酸、氢氧化钠、氯化钠，β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）、乙醇(70%)。

6.2.2引物合成

根据真实性验证或身份鉴定的要求，采用序贯式方法，选定表1的引物。选用变性PAGE垂直板电

泳，只需合成普通引物。选用荧光毛细管电泳，需要在上游或下游引物的5’端标记与毛细管电泳仪发

射和吸收波长相匹配的荧光染料。具体引物分组信息可参考附录C。

6.2.3PCR扩增

2+

dNTPs、Taq酶、10×缓冲液、矿物油、ddH2O、引物和Mg。

6.2.4电泳

6.2.4.1毛细管电泳

与使用的基因测序仪型号相匹配的分离胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液。

6.2.4.2变性PAGE垂直板电泳

去离子甲酰胺（Formamide）、溴酚蓝（BrphBlue）、二甲苯青（FF）、甲叉双丙烯酰胺（Bisacrylamide）、

丙烯酰胺（Acrylamide）、硼酸（BoricAcid）、尿素、亲和硅烷（BindingSilane）、疏水硅烷（Repel

Silane）、DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、冰醋酸、乙

酸铵、硝酸银、甲醛、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O）.

6.3溶液配制

DNA提取、PCR扩增、电泳、银染的溶液按照附录A（规范性附录）规定的要求进行配制，所用

试剂均为分析纯。

试剂配制所用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求，其中银染溶液的配制可以使用符合三级

要求的水。

7检测程序

7.1DNA提取

7.1.1SDS法

试样种子充分研磨后，取100～200mg种子粉末置于2.0mL离心管，每管加入700µL的SDS提取液，

混匀。65℃水浴30min，期间多次轻缓颠倒混匀。每管加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）混合

液，上下颠倒混匀至不分层，12,000rpm离心10min。吸取上清液，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻颠

倒混匀至絮状DNA成团析出。用剪口枪头吸取DNA，转移至盛有70%乙醇的离心管中洗涤一次，无水

乙醇再洗涤一次，自然条件下干燥，加入200µL超纯水或TE缓冲液，充分溶解后4℃备用。

7.1.2CTAB法

取试样的幼苗或叶片约100～200mg置于2.0mL离心管，液氮冷却后充分研磨，每管加入700µL经

65℃预热的CTAB提取液，充分混匀，65℃水浴30min。期间多次轻缓颠倒混匀。每管加入等体积的三

氯甲烷/异戊醇（24:1）混合液，充分混合后12,000rpm离心10min。吸取上清液，加入等体积预冷的异

丙醇，轻轻颠倒混匀至絮状DNA成团析出。用剪口枪头吸取DNA，转移至盛有70%乙醇的离心管中洗

涤一次，无水乙醇再洗涤一次，自然条件下干燥，加入200µL超纯水或TE缓冲液，充分溶解后备用。

7.1.3试剂盒法

选用适宜SSR标记法的商业试剂盒，并经验证合格后使用。DNA提取方法，按照试剂盒提供的使

用说明进行操作。

注:DNA提取可选8.1.1、8.1.2、8.1.3或其它达到PCR扩增质量要求的方法。

7.2PCR扩增

7.2.1反应体系

PCR扩增反应体系的总体积和组分的终浓度参照表2进行配制，可以依据试验条件不同作相应调

整。

表2PCR扩增反应体系

反应组分原浓度终浓度推荐反应体积（20L）

ddH2O－－13.0

10×缓冲液

(含25mmol/L10×1×2.0

MgCl2)

dNTPs2.5mmol/Leach0.2mmol/Leach1.6

Taq酶5U/L1U/µL0.2

正向引物20mol/L0.1mol/L0.1

反向引物20mol/L0.1mol/L0.1

DNA40ng/L6.0ng/L3.0

7.2.2反应程序

反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶等不同而作适当的调整。通常采用下列反应程

序：

a)预变性：94℃5min；

b)扩增：94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共32次循环；

c)终延伸：72℃10min。

扩增产物置于4℃保存。

7.3扩增产物分离

7.3.1毛细管电泳

7.3.1.1按照预先确定的组合引物，等体积取同一组合引物的不同荧光标记的扩增产物，充分混匀。从

混合液中吸取1L，加入到基因测序仪专用96孔上样板上。每孔再分别加入0.15L分子量内标和8.85

L去离子甲酰胺，95℃变性5min，冷却10min以上，瞬时离心10s后备用。

7.3.1.2打开基因测序仪，检查仪器工作状态和试剂状态。

7.3.1.3将装有样品的96孔上样板放置于样品架基座上，将装有电极缓冲液的buffer板放置于buffer板

架基座上，打开数据收集软件，按照基因测序仪的使用手册进行操作。基因测序仪将自动运行参数，

并保存电泳原始数据。

7.3.2变性PAGE垂直板电泳

7.3.2.1制胶

沾洗涤灵用清水将玻璃板反复擦洗干净，再用去离子水、无水乙醇分别擦洗两遍。玻璃板干燥后，

将1mL亲和硅烷工作液，均匀涂在无凹槽的玻璃板上；将1mL疏水硅烷工作液，均匀涂在带凹槽的玻

璃板上。操作过程中两块玻璃板分别处理，防止相互污染；玻璃板彻底干燥后，将塑料隔条整齐放在

无凹槽玻璃板两侧，盖上凹槽玻璃板，夹子固定后，用水平仪检测玻璃胶室是否水平；取60mL6%PAGE

胶，加入100L的TEMED和200L10%过硫酸铵（过硫酸铵的用量与温度成反比，需根据温度调整用

量），迅速混匀，将胶灌入玻璃胶室，灌胶过程应防止气泡的出现。待胶室灌满后，在凹槽处将鲨鱼

齿朝外轻轻插入样品梳，在室温下聚合1h以上，轻轻拔出梳子，用清水洗干净备用。

7.3.2.2变性

取20l扩增产物，加入5L的6×加样缓冲液，混匀。95℃变性5min，4℃冷却10min后备用。

7.3.2.3电泳

7.3.2.3.1将清洗后的胶板安装于电泳槽上，在电泳正极槽（下槽）与负极槽（上槽）各加入800mL的

1×TBE缓冲液，拔出样品梳，90W恒功率预电泳10~20min。用移液器吹吸加样槽，清除气泡与杂质，

插入样品梳。每一个加样孔加入5L变性样品（见7.4.2.2）,90W恒功率电泳。

7.3.2.3.2电泳的适宜时间参考二甲苯青指示带移动的位置和扩增产物预期片段大小范围（参见表B.1）

加以确定。二甲苯青指示带在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中移动的位置与230bp扩增产物泳动的

位置大致相当。100~200bp扩增产物的电泳时间约为35min；200~300bp扩增产物电泳时间约为40min，

300~450bp扩增产物电泳时间约为50min。电泳结束后关闭电源，取下玻璃板并轻轻撬开，凝胶附着在

无凹槽的玻璃板上。

7.3.2.4染色

将粘有凝胶的长玻璃板浸入“固定液”中轻轻晃动5min；去离子水快速漂洗1次；“染色液”中染色5

min～10min；去离子水快速漂洗1次；“显影液”中轻轻晃动至带纹出现；“固定液”中定影5min；去离

子水漂洗后晾干胶板，放在胶片观察灯上观察记录结果，用数码相机或凝胶成像系统拍照保存。

注：固定液、染色液、去离子水和显影液的用量，可依据胶板数量和大小调整，以没过胶面为准。

7.4数据分析

7.4.1总则

电泳结果需要通过规定程序进行数据分析降低误读率。在引物等位变异片段大小范围内（参见表

B.1），对于毛细管电泳，特异峰呈现为稳定的单峰或连续峰型；对于变性PAGE垂直板电泳，特异谱

带呈现稳定的单谱带或连续谱带。

注：当出现非纯合SSR位点时，毛细管电泳中会呈现两个单峰或两个连续峰，在变性PAGE垂直板电泳中会显示为

稳定的两种单谱带或两种连续谱带。

7.4.1.1对于毛细管电泳，由于不同引物扩增产物表现不同、引物不对称扩增、试验条件干扰等因素，

可能出现不同状况的峰型，按照以峰高为主、兼顾峰型的原则依据下列规则进行甄别、过滤处置：

1)对于连带（pull-up）峰，即因某一位置某一颜色荧光的峰值较高而引起同一位置其它颜色荧

光峰值升高的，应预先将其干扰消除后再进行分析；

2)对于（n+1）峰，即同一位置出现两个相距1bp左右的峰，应视为单峰；

3)对于连续多峰，即峰高递增或峰高接近的相差一个重复序列的连续多个峰，应视为单峰，取

其最右边的峰，峰高值为连续多个峰的叠加值；

4)对于高低峰，应通过设定一定阈值不予采集低于阈值的峰；

5)对于有2个及以上特异峰，应考虑是由非纯合SSR位点或混入杂株所致。

注：当存在非纯合SSR位点时，将会有两个特异峰，此时需要采集两个峰值。

7.4.1.2对于变性PAGE垂直板电泳，位于相应等位变异扩增片段大小范围之外的谱带需要甄别是非特

异性扩增还是新增的稀有等位变异。采用单个个体扩增的产物，出现3种及3种以上的多带则为非特

异性扩增；采用混合样提取的，某些位点出现3种及3种以上的谱带或上下有弱带等情况出现时，则

需要通过单个个体进行甄别。

7.4.1.3采取混合样检测时，无论是毛细管电泳还是变性PAGE垂直板电泳，结果表明在引物位点出现

异质性而影响差异位点判定时，应采用单个个体独立检测，试样至少含有30个个体。

7.4.2数据分析和读取

7.4.2.1毛细管电泳

导出电泳原始数据文件，采用数据分析软件对数据进行甄别。

a)设置参数：在数据分析软件中预先设置好panel、分子量内标、panel的相应引物的Bin（等位

变异片段大小范围区间）；

b)导入原始数据文件：将电泳原始数据文件导入分析软件，选择panel、分子量内标、Bin、质

量控制参数等进行分析；

c)甄别过滤处置数据：执行7.5.1的规定。

数据比对采用7.5.3.1、7.5.3.2方式的，应分别通过同时进行试验的标准样品、参照样品（依据引物

选择少量的对照），校准不同电泳板间的数据偏差后再读取扩增片段大小。甄别后的特异峰落入Bin范

围内，直接读取扩增片段大小；若其峰大多不在Bin范围内，可将其整体平移尽量使峰落入Bin设置范

围内后读取数据。

7.4.2.2变性PAGE垂直板电泳

对甄别后的特异谱带（见7.5.1）进行读取。扩增片段大小的读取，统一采用两段式数据记录方式。

纯合位点数据记录为X/X，非纯合位点数据记录为X/Y（其中X、Y分别为该位点两个等位基因扩增片

段），小片段数据在前，大片段数据在后，缺失位点数据记录为0/0。

7.4.3数据比对

7.4.3.1采用与标准样品比较的，对甄别后的特异峰，按照在同一电泳板上的供检样品与标准样品逐个

位点进行两两比较，确定其位点差异。

7.4.3.2采用毛细管电泳与SSR指纹数据比对平台比对的，按照数据导入模板的要求，将数据及其指纹

截图上传到SSR指纹数据比对平台，进行逐个位点在线比对，核实确定相互间的指纹数据的异同。

7.4.3.3采用PAGE垂直板电泳与SSR指纹数据比对平台比对的，按照数据导入模板的要求，将数据上

传到SSR指纹数据比对平台，进行逐个位点的两两比对，核实确定相互间的指纹数据的异同。

注：采用PAGE垂直板电泳与SSR指纹数据比对平台比对较为困难，建议作为参考使用，比对前采取以下措施：

a）读取扩增产物片段大小数据的，供检样品与参照样品（附录B）同时在同一电泳板上电泳；

b）电泳时间足够，符合7.4.2.3.2的要求；

c）供检样品存在扩增片段为一个基序差异的，按片段大小顺序重新电泳进行复核确定后读取。

7.4.4数据记录

数据比对后，按照位点存在差异或相同、数据缺失、无法判定等情形，记录每个引物的位点状况。

8结果计算与表示

统计位点差异记录的结果，计算差异位点数，核实差异位点的引物编号。

检测结果用供检样品和标准样品比较的位点差异数表示，检测结果的容许差距不能大于2个位点。

对于在容许差距范围内且提出有异议的样品，可以参照GB/T3543.5的规定进行田间小区种植鉴定。

9结果报告

9.1按照GB/T3543.1的检验报告要求，对品种真实性验证或身份鉴定的检测结果进行填报。

9.2对于真实性验证，选择下列方式之一进行填报：

a)通过对引物，采用电泳方法进行检测，与标准样品比较未能检测出位点差异。

b)通过对引物，采用电泳方法进行检测，与标准样品比较检测出差异位点数个，

差异位点的引物编号为。

9.3对于品种身份鉴定，采用下列方式进行填报：

通过对引物，采用电泳方法进行检测，经与SSR指纹数据比对平台筛查，供检样品

与品种未能检测出位点差异。

9.4属于下列情形之一的，需在检验报告中注明：

——供检样品低于5.4.1规定数量的；

——与SSR指纹数据比对平台进行数据比对的；

——供检样品遗传不稳定严重的位点（引物编号）清单；

——检测采用了其他SSR引物的名称及序列。

AA

附录A

（规范性附录）

溶液配制

A.1DNA提取

A.1.10.5mol/LEDTA溶液

称取186.1gNa2EDTA.2H2O溶于800mL水中，加固体NaOH调pH至8.0，加水定容至1000mL，121℃

高压灭菌20min。

A.1.21mol/LTris-HCl溶液

称取60.55gTris碱溶于适量水中，加HCl调pH至8.0，加水定容至500mL，121℃高压灭菌20min。

A.1.30.5mol/LHCl溶液

浓盐酸(36%～38%)25mL，加水定容至500mL。

A.1.4CTAB提取液

5mol/LNaCl280mL、CTAB20g、1mol/LTris-HCl100mL、0.5mol/LEDTA40mL，山梨醇5g、PVP

10g加水定容至1000mL，4℃贮存。使用前加入10mlβ-巯基乙醇。

A.1.5SDS提取液

1mol/LTris-HCl50mL、0.5mol/LEDTA20mL、5mol/LNaCl140mL和SDS10g混合、山梨醇5g和

PVP10g，加水定容至1000mL。使用前加入10mlβ-巯基乙醇。

A.1.61×TE缓冲液

1mol/LTris-HCl5mL和0.5mol/LEDTA1mL，加HCl调pH至8.0，加水定容至500mL，121℃高压

灭菌20min。

A.1.75mol/LNaCl溶液

固体NaCl146g，加水定容至500mL。

A.1.8苯酚:氯仿:异戊醇混合液

体积比为25:24:1。

A.2PCR扩增

A.2.1SSR引物

用TE缓冲液或超纯水分别配制正向引物、反向引物终浓度均为40mol/L的储存液。

A.3电泳

A.3.140％PAGE胶

丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g，加水定容至500mL。

A.3.26×加样缓冲液

去离子甲酰胺49mL、0.5mol/LEDTA1mL、溴酚兰0.125g和二甲苯青0.125g混合。

A.3.36%PAGE胶

尿素450g、10×TBE缓冲液100mL和40%PAGE胶150mL，加水定容至1000mL。

A.3.4亲和硅烷缓冲液

无水乙醇49.75mL和冰醋酸250L。

A.3.5亲和硅烷工作液

亲和硅烷缓冲液1mL和Bind原液10L混合。

A.3.6疏水硅烷工作液

95ml三氯甲烷中加入5ml疏水硅烷原液。

A.3.710%过硫酸铵溶液

0.1g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。

A.3.810×TBE缓冲液

Tris碱108g、硼酸55g和0.5mol/LEDTA37mL，加水定容至1000mL。

A.3.91×TBE缓冲液

10×TBE缓冲液100mL，加水定容至1000mL。

A.4银染

A.4.1固定液

100mL的无水乙醇和5mL的乙酸，加水定溶至1000mL。

A.4.2染色液

2g的硝酸银（AgNO3），加水定溶至1000mL。

A.4.3显影液

30g的固