医学生物化学实验-教案教程文件

医学生物化学实验-教

案

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《医学生物化学实验》教案

第1次课2学时

实验项目3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定还原糖

实验性质设计性实验

1、了解糖的还原性

教学目的和

2、掌握还原糖定量测定的原理和方法。

要求

3、熟悉分光光度计的使用方法。

教学重点与重点:绘制标准曲线的方法，分光光度计的使用原理和使用方法。

难点难点：标准曲线的应用。

1试.剂

(1)Img/mL葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖lOOmg,加少

量蒸僧水溶解后，以蒸储水定容至100mL,即含葡萄糖为1.0mg/mL。

(2)3,5-二硝基水杨酸试剂：称取6.3g3,5-二硝基水杨酸并量取262

mL2mol/LNaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中(182g酒石酸钾纳溶于500

mL水中)，再加5g结晶酚和5g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却

实验材料

后定容到1000mL贮于棕色瓶中。

(3)未知浓度还原糖。

2材.料

小麦淀粉或玉米淀粉。

3器.材

分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。

一、实验原理★:在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸(DNS)

与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化

合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原

糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

OHNO2OHNH2

HOOC^^S>+还原糖—-HOOC—

NO2NO2

(DNS)(3-氨基一5一硝基水杨酸)？

黄色桔红色

二、实验步骤：

实验内容

1.取7支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为Img/mL的葡萄糖标准液、蒸僧

水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。

表1葡萄糖标准曲线制作

竹且lmg/ml葡萄糖蒸储水DNS葡萄糖含光密度值(OD.

标准液(mL)⑥(_)(mL)量(mg)540nm)

100.50.50

20.10.40.50.1

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30.20.30.50.2

40.30.20.50.3

50.40.10.50.4

60.500.50.5

7（未知浓度还原

、0.500.50.5

格）

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min取出，冷却至室温，用蒸储水补足至

5mL,加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm,用1号管调零

点，分别测出2~6号管的光密度值。

2.绘制标曲▲

以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线(电脑

Excel完成最好)。计算7号管还原糖的百分含量。

三、结果与计算▲:

计算出7号管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，

按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。

查曲线所得葡萄糖毫克数X提取液总体积/测定时取用体积

还原糖(%)=X

100%

样品毫克数

教学过程中师生活动设计

糖的还原性，具有还原性的糖结构有何特点？

提纲、板书设计

实验原理及反应方程式，实验步骤中表1及计算公式

1、为什么要设置空白对照？

作业

2、标准曲线的定义？

主要[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013

参考资料[2]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

1、让学生理解糖定量测定的原理及方法；

总结分析2、强调标准曲线的绘制要点；

3、需要和学生一起推导还原糖浓度的公式

《医学生物化学实验》教案

第2次课2学时

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实验项

糖的呈色反应和还原糖检验

目

实验性

验证性实验

质

教学目1.了解糖类某些颜色反应的原理

的和要2.学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法

求

教学重重点：颜色反应鉴别糖的方法

点与难难点：鉴别糖的反应原理

点

1、仪器：试管及试管架、滴管、移液管及恒温水浴锅

实验材

2、试剂：莫氏试剂、塞氏试剂、托伦试剂；1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶

料

液、1%果糖溶液、1%阿拉伯糖溶液、1%半乳糖溶液

一、实验原理★:

a—蔡酚反应：糖在浓无机盐作用下，脱水生成糠醛衍生物，后者在浓硫

酸的作用下能与a—蔡酚生成紫红色物质，在糖液面与浓硫酸液面间出现紫色

环。但一些非糖物质对此反应也呈阳性

间苯二酚反应：在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基醛，后者可与间苯二酚

作用生成红色物质。此反应是酮糖的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应

慢。

托伦反应：戊糖在浓酸作用下脱水生成糠醛，后者可与间苯三酚结合生成

樱桃红色物质。本反应常用来鉴定戊糖，戊糖此反应最快，可以和其他糖类区

分。

二、操作步骤▲:

a—蔡酚反应：先取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%淀粉溶液、1%蔗糖溶液，然

实验内后向3支试管中各加入2滴莫氏试剂，混匀。另外取1支试管，只加2滴莫氏试剂作为空

容白对照，倾斜4支试管，沿各试管壁缓慢加入浓硫酸约1.5mL,慢慢立起试管，切勿摇

动。试管中液体分成两层，浓硫酸在试液下面。在两液分界处有紫红色环出现。观察、记

录各管颜色。

间苯二酚反应：取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液

各0.5mL。再向各管分别加入塞氏试剂2.5mL,混匀。将3支试管同时置于沸水浴中，注

意观察颜色的变化及变化时间。

托伦反应：取3支试管，分别加入1%阿拉伯糖溶液、1%半乳糖溶液、1%葡萄糖溶

液各0.1mL,再向各管分别加入托伦试剂1mL,混匀。将3支试管同时置于沸水浴中，

观察、记录颜色的变化及颜变化的时间。

教学过程中师生活动设计

观察和记录各管颜色及颜色变化的时间后，说出各管颜色变化的原因。

提纲、板书设计

原理及操作步骤

1.简述a—蔡酚反应原理。

作业

2.可用何种颜色反应鉴别酮糖存在。

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主要[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013

参考资[2]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

料

总结分1、让学生掌握糖显色反应的原理；

析2、给学生强调注意观察各管颜色变化的时间

《医学生物化学实验》教案

第3次课2学时

实验项目蛋白质等电点和沉淀反应

实验性质基础性实验

1.了解蛋白质的两性解离性质。

教学目的和

2学.习测定蛋白质等电点的方法。

要求

3.了解蛋白质变性与沉淀的关系及沉淀蛋白质的方法以及其实用意义。

重点：学习测定蛋白质等电点的方法及沉淀蛋白质的方法。

教学重点

难点：蛋白质变性与沉淀的关系，沉淀的蛋白质不一定表现为变性；变性

与难点

的蛋白质不一定表现为沉淀。

（一）材料

新鲜鸡蛋

（二）试剂

1、0.4%酪蛋白醋酸钠溶液200mL

2、1.00mol/L醋酸溶液100mL

3、0.10mol/L醋酸溶液300mL

4、0.01mol/L醋酸溶液50mL

5、蛋白质溶液500mL

5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清:水=1:9）

6、pH4.7醋酸一醋酸钠的缓冲溶液100mL

实验材料7、3%硝酸银溶液10mL

8、5%三氯乙酸溶液50mL

9、95%乙醇250mL

10、饱和硫酸镀溶液250mL

11、硫酸镂结晶粉末10000mL

12、0.1mol/L盐酸溶液300mL

13、0.1mol/L氢氧化钠溶液300mL

14、0.05mol/L碳酸钠溶液300mL

15、甲基红溶液20mL

（三）器具

水浴锅、温度计、200mL锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管及试管架

实验内容1.实验原理★:

蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：

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COOH

P

NH2

童白质分子

COO-+七COO-+H.COOH

阴喜干鬃性离于阳离子

pH>pIpH=plpH<pl

最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。

蛋白质的沉淀反应可分为两类。

（1）可逆的沉淀反应

此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋

白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多

数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。

提纯蛋白质时，常利用此类反应。

（2）不可逆沉淀反应

此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶

于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固。蛋白质与重金属离子或某

些有机酸的反应都属于此类。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），

并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未

必都已变性。

二、实验步骤：

（一）酪蛋白等电点的测定

（1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然

后混匀。

蒸储水0.01mol/Ldig

0.1mol/L蜡1.0mol/L

试管号（mL酸

酸(mL)蜡酸(mL)

）(mL)

18.40.6-—

28.7-0.3—

38.0-1.0—

47.4--1.6

（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL,加一管，摇匀一

管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。

静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电

点。

（二）蛋白质的沉淀及变性

1、蛋白质的盐析

无机盐（硫酸镂、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓

度不同，析出的蛋白质也不同。

如球蛋白可在半饱和硫酸镂溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸镂溶液

中才能析出。

由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋

白质的盐析作用是可逆过程。

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加蛋白质溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸镂溶液，混匀后静

置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否

溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸镂粉末到不再溶解为

止。此时析出沉淀为清蛋白。

取出部分清蛋白，加少量蒸储水，观察沉淀的再溶解。

2、重金属有穹子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合

物。

取1支・或管，加入蛋白质溶液2mL,再加3%硝酸银溶液1一2滴，振

荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，

沉淀是否溶解？为什么？

3、某些有方儿酸沉淀蛋白质

取1支试管，加入蛋白质溶液2mL,再加入lmL5%三氯乙酸溶液，振

荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻倾出清液，向沉淀中加入少量水，观

察沉淀是否溶解。

4、有机溶?q」沉淀蛋白质

取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇。观察沉淀的

生成(如果沉淀不明显，加点NaCl,混匀。

5、乙醇引声G的变性与沉淀

取3支试,管，编号。依下表顺序加入试剂：

试剂0.1mol/L

(mL蛋白质0.1mol/LpH4.7缓

氢氧化钠95%乙醇

)溶液盐酸溶液冲溶液

管号溶液

1111

2111

3111

振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻向各管内加入水8mL,然后

在第2,3-省管中各加一滴甲基红，再分别用O.lmol/L醋酸溶液及

0.05mol/LE受酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再

加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现

象。

教学过程中师生活动设计

蛋白质沉淀原理，什么是蛋白质变性？根据性质推测其应用

提纲、板书设计

原理及简要操作步骤

1.什么是等电点？

作业2.临床上为什么可以用蛋清或牛乳解救误服金属盐的病人？

主要[1]《生物4匕学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013

参考资料[2]《生物伙，学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，

2010

1、通过原土里分析，帮助学生理解“沉淀的蛋白质不一定表现为变性；变性

总结分析的蛋白质不一定表现为沉淀”；

2、重点区手山“可逆沉淀”与“不可逆沉淀”

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《医学生物化学实验》教案

第4次课2学时

实验项蛋白质和氨基酸显色反应

目

实验性基础性实验

质

教学目1.学习和了解常用的几种鉴定蛋白质与氨基酸的方法。

的和要

求2.了解蛋白质与氨基酸的显色反应原理。

教学重重点：蛋白质与氨基酸的显色反应原理。

点与难难点：鉴定蛋白质与氨基酸的方法。

八占、、

试剂:0.5%醋酸铅1mL、10%NaOH、1%CUSO

实验材4

器具：水浴锅、温度计、200mL锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管及试管

料

架

一、实验原理★:

1.双缩服反应（biuretreaction）

蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此

反应称为双缩胭反应，双缩版反应可用来检测蛋白质水解程度。

2.苯环的黄色反应

Tyr（Trp）+浓硝酸一►黄色

Phe+少量浓硫酸+浓硝酸一>黄色

3.醋酸铅反应（半胱氨酸和胱氨酸）

R-SH+2NaOH-►R-OH+Na2S+H2O

Na2s+Pb2+―>PbS+2Na+

PbS+2HCl—►PbCb+H2s

二、实验步骤▲:

实验内1.双缩股反应（biuretreaction）

容取1支试管，加乳蛋白溶液（蛋清冰=1:9）约1mL和10%NaOH约2mL,

摇匀，再加l%CuSCU溶液2滴，随加随摇。观察现象，记录。

2.苯环的黄色反应

问6个试营中按卜表力口试剂，观祭现象开记求。鸡蛋清溶液（蚩清:水=1:9）

管号123456

材料鸡蛋清指甲头发0.5%苯酚0.3%色氨酸0.3%酪氨酸

液

（滴）4少许少许444

浓硝酸22020444

（滴）

现象

逐滴加

10%NaOH

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后现象变

化

3.醋酸铅反应

0.5%醋酸铅1mL、10%NaOHlmL、卵清蛋白1mL三样试剂混匀加热，观

察现象。然后冷却至20~30℃,加10滴浓HCL,再将湿润的醋酸铅试纸放于

管口，加热，嗅其气味同时观察试纸颜色变化。

教学过程中师生活动设计

含苯环的氨基酸有哪些？双缩版反应颜色与什么相关？

提纲、板书设计

原理及简要操作步骤

1.在实验室如何区分核酸和蛋白质？

作业

2.黄色反应中为何会出现深浅不一的黄色？

主要[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013

参考资

[2]《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010

料

总结分1、实验过程中让学生重点观察颜色变化的过程；

析2、醋酸铅反应的每一步都要记录现象

《医学生物化学实验》教案

第5次课2学时

实验项糖的薄层层析

目

实验性基础性实验

质

教学目1.了解薄层层析的基本原理。

的和要2.熟悉薄层层析的操作过程。

求

教学重重点：掌握薄层层析的吸附原理。

点与难难点：掌握分配系数，Rf值。

/占、、、

实验材

四种糖样品、染色液、扩展剂、层析缸、层析板等

料

一、实验原理★:

薄层层析（简称TLC）是在吸附层析基础上发展起来的一种微量而快速的层析

法，它是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层析。为了使所

实验内要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。硅胶、氧化铝和聚酰胺

容是广泛采用的吸附剂，在吸附剂或支持剂中添加合适的粘合剂后再涂布，可使薄

层紧贴在玻璃板上。

糖是多羟基化合物在硅胶G薄层上展层时，被吸附的强弱有差异，同时在

展开剂中溶解性质也有差异。吸附力主要与糖的相对分子质量和羟基数有关，一

般为三糖〉二糖〉单糖，醛糖〉酮糖〉脱氧糖。经过适当的溶剂展开后，糖在薄

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板上的移动速度是戊糖〉己糖〉双糖〉三糖。

薄层层析与其他方法比有明显的优点：层析时间短、样品用量范围大(1圈-

0.5g)、观察结果方便、可以分离多种化合物等，其灵敏度比纸层析高10-100

倍，显色方法甚至可以用腐蚀性显色剂。而且薄层层析法操作方便，设备简单，

所以薄层层析法目前应用范围相当广泛。

二、实验步骤▲:

1.点样

选取制备好的薄板一块，在距底边1.5cm的直线上均匀选4个点。用毛细管

分别点上不同的糖样品于4个点，样品量控制在5-10隔，斑点直径不超过

3mm。点样完毕，立即用电热吹风机吹干样点。

2.展层

将薄板置于盛有层析溶剂的层折缸中，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄

板顶端约1cm处时取出薄板，在溶剂前沿处作一记号，于80℃下烘干5min。

3.显色

除尽溶剂后，向薄层板上喷雾糖显色剂，于80℃下烘干lOmin,则各种糖分

别显出不同的颜色。

三、实验结果上・

(1)记下各斑点的位置、颜色，计算Rf值。

(2)鉴定混合糖中糖的种类，并绘出层析图谱。

教学过程中师生活动设计

还有哪些层板方法？

提纲、板书设计

原理及简要操作步骤

作业何谓Rf值？Rf值与什么因素有关？

《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，

主要参[1]2010

⑵《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，

考资料2010

1、点样是本实验的关键，教师在指导学生操作时，强调点样要轻、快，稳、小

总结分

并且点样点要集中；

析2、施展£时，点储点不要浸如展层溶液中

《医学生物化学实验》教案

第6次课2学时

实验项酶的特性

目

实验性基础性实验

质

教学目掌握酶促反应速度的几个主要影响因素

的和要了解淀粉水解程度的鉴定。

求

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教学重重点：唾液淀粉酶催化的酶促反应；淀粉水解程度的判断。

点与难难点：酶活性的影响因素。

点

仪器：水浴锅、电炉、白瓷板、试管、量筒、漏斗、脱脂棉。

实验材

试剂：0.2%、0.5%淀粉液、0.3%NaCl、0.85%NaCl溶液、1%CUSC）4溶液、

料

l%Na2so4、pH=5.0、pH=8.0、pH=6.8缓冲溶液。

一、实验原理★:

温度与酶促反应速度关系密切。温度降低时，酶促反应速度降低以至完全

停止；随着温度升高，反应速度逐渐加快。在某一温度时反应速度达到最大

值，此温度称酶作用的最适温度。温度继续升高，反应速度反而下降。人体内

大多数酶的最适温度在37℃左右。

pH值也会影响酶促反应速度。因为酶本身是蛋白质，pH不仅影响酶蛋白分

子某些基团的解离，也影响底物的解离程度，从而影响酶与底物的结合。当酶

促反应速度达到最大值时的溶液pH值，称为该酶的最适pH。不同的酶最适

pH值不尽相同，人体多数酶的最适pH值在7.0左右。例如唾液淀粉酶的最适

pH值为6.8。

凡是能够提高酶活性，加快酶促反应速度的物质都称为酶的激活剂。例如

cr是唾液淀粉酶的激活剂。

凡是能够降低酶的活性，使酶促反应速度减慢，又不使酶变性的物质称为

酶的抑制剂。例如C/+是唾液淀粉酶的抑制剂。

在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度不同，可由水解混合物遇碘显

现的颜色不同来判断：

淀粉（蓝色）f红色糊精（红色）一无色糊精（不显色）+麦芽糖（不显色）〉葡萄糖

实验内（不显色）

容二、实验步骤：

1.制备稀释50倍的唾液淀粉酶：用蒸储水漱口清除食物残渣，再含一口蒸储水

一分钟

后使其流入量筒并稀释50倍，混匀备用。

2温.度对酶促反应速度影响实验

（1）取试管3支，编号，各管按下表依次加入各种试剂。

__________温度对酶促反应速度影响实验加样表

管号123__________________

0.1%淀粉溶液（mL）1.51.51.5

稀释唾液（ml）111

煮沸唾液一一1

摇匀

水浴温度37℃0℃37℃____________

（2）水浴8min后，向各管中各滴加1滴KI-L溶液，混匀，观察各管颜色并

解释结果上

3.pH对酶促反应速度的影响实验

（1）取试管3支，编号，按下表依次加入各种试剂。

______________pH对酶促反应速度影响实验加样表________

管号123

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0.2%淀粉液(mL)222

PH5.0缓冲液(mL)3——

PH6.8缓冲液(mL)—3

PH8.0缓冲液(mL)——3

稀释唾液酶(mL)222

(2)混匀后，将各管置于37℃水浴5分钟后，取2号管中混合液1滴于点滴

板上，加1滴KI-L溶液显色，以检验淀粉的水解程度。若不是棕黄色，则继

续保温，然后每隔Imin继续取2号管的混合液1滴于点滴板上，加1滴KI-L

溶液显色，直至变成棕黄色时，向所有试管内依次滴加2滴KI-b溶液显色。

观察各管颜色并解释结果

4.激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响

(1)取试管4支，编号，按下表依次加入各种试剂。

激活剂和抑制剂对酶促反应速度影响实验加样表

管号1234

0.1%淀粉液(mL)1.51.51.51.5

l%NaCl溶液(mL)2———

1%Na2s04溶液(mL)—2

1%CUSO4溶液(mL)——2

蒸储水(mL)———2

稀释唾液酶(mL)0.50.50.50.5

(2)混匀后，将各管置于37c水浴8分钟后，取1号管中混合液1滴于点滴

板上，加1滴KI%溶液显色，以检验淀粉的水解程度。若不是棕黄色，则继

续保温，然后每隔Imin继续取1号管的混合液1滴于点滴板上，加1滴KI-I2

溶液显色，直至变成棕黄色时，向所有试管依次滴加1滴KI-I2溶液显色。观

察各管颜色并解释结果

教学过程中师生活动设计

随着淀粉水解，为什么与碘有颜色反应变化？

提纲、板书设计

原理及简要操作步骤

1在作离子对酶活的影响时3、4号管有何作用？

2.在激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响实验中如何证明cr是唾液淀粉酶的

作业

激活剂？

3.酶的抑制剂与变性剂有何区别？

主要参[1]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

考资料[2]《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010

1、对照实验要注意同步性；

总结分

2、不同人的唾液淀粉酶活性不尽相同，让学生注意到样本差异；

析

3、重点分析激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响

《医学生物化学实验》教案

第7次课2学时

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实验项目Folin-酚试剂法测蛋白质浓度

实验性质综合性实验

教学目的1.学习会用Folin-酚试剂法测蛋白质浓度的方法。

和要求2.巩固分光光度计的使用。

教学重点1、重点：分光光度计的使用

与难点2、难点：标准曲线的绘制

试剂：标准蛋白溶液，Folin-酚试剂，样品液蛋白质

实验材料

器材：分光光度计、恒温水浴锅、试管、移液管

一、实验原理支

Folin-酚试剂法测蛋白质浓度的显色原理与双缩胭方法是相同的，只是加入了第

二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这

两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成

复合物。Folin-酚试剂中的磷铝酸盐-磷鸨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基

还原，产生深兰色（钥兰和鸨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的

量成正比。

二、实验步骤上

1.曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两

组，分别加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为

250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合

器上迅速混合，于室温（20〜25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙

（Folin-酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。

实验内容

然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于

700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座

标，绘制出标准曲线。

2.样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进

行操作，取1毫升蒸储水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线

的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。

如上表中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样

品溶液的蛋白质浓度

教学过程中师生活动设计

测定蛋白质浓度其他方法有哪些？

提纲、板书设计

原理及简要操作步骤

作业简述Folin-酚试剂法比较其他蛋白质测定方法的优点。

主要[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013

参考资料[2]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

1、强调Folin-酚试剂法测蛋白质浓度的显色原理；

总结分析

2、巩固分光光度计的使用

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《医学生物化学实验》教案

第8次课2学时

实验项血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

目

实验性基础性实验

质

教学目1.了解电泳技术的一般原理。

的和要2.掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作。

求

教学重重点：掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作方法。

点与难难点：电泳技术的原理。

点

器材：DYY-HI6型常压电泳仪、醋酸纤维薄膜（2cmx8cm）、.培养皿、盖玻

片、滤纸、镜子。

试齐

1.巴比妥缓冲液（pH8.6,离子强度0.07）：巴比妥2.76g,巴比妥钠15.45g,用

实验材蒸储水定容至1000mL。

料2.染色液：氨基黑10B0.25g,用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重

复使用）。

3.漂洗液:甲醇或乙醇45mL,冰醋酸5mL,水50mL,混匀。

4.透明液（仅在定量分析时使用）：无水乙醇7份，冰醋酸3份，混匀。

一、实验原理★:

电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。醋酸

纤维薄膜电泳（CAME）是一种区带电泳技术，将血清样品点样于醋纤膜上，在

pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋

白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳

迁移率不同，彼此得以分离。

影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电

渗现象。

影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。

实验内

本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，它是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维

容

素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂

抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约

为120nm,有很强的通透性，对分子移动阻力很小。醋酸纤维素薄膜电泳具有

微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。

本实验中用于电泳分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、a-球蛋白、p-球

蛋白、丫-球蛋白和各种脂蛋白等，各种蛋白质在电场中的迁移速度不同。正常人

血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速

度最快，其余依次为al-、a2-、（3-及y-球蛋白。

二、实验步骤：1）预处理；2）点样：3）电泳；4）染色；5）漂洗，吸干。

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1预.处理：用镜子取醋酸纤维薄膜2张，识别出光泽面与粗糙面，将粗糙面朝上

放在电泳槽中的缓冲液中浸泡20mino

2点.样：事先用点样器在滤纸上点几个样，熟悉一下点样器的用法。然后把膜条

从缓冲液中取出，夹在两层滤纸内用手指快速捋一下，以吸干表面多余的液体，

随即将粗糙面朝上平铺在玻璃板上。注意，切勿将膜条长时间放在滤纸上，以免

膜条中的缓冲液过度吸出。用盖玻片蘸一点血清，使血清均匀地分布在盖玻片切

面。将盖玻片在膜条一端2~3cm处轻轻地垂直落下并随即提起，这样即在膜条上

点上了细条状的血清样品，每张膜点一个样。（要求：轻、匀、直、细）

3.电泳：预先要在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，做好滤

纸桥。用镶子将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，要平直。膜条光面朝上，点

样端靠近负极、且悬空（可用镜子再将膜条两端压服帖一些）。盖严电泳室，检

查一下电泳槽和稳压电源是否已经连接好。通电，调节电压至110V,电泳时间

约为30min。

4.染色：电泳完毕后，关上电源开关，用镜子将薄膜条取下并放在装有染色液

的培养皿中浸泡3~4min（注意盖好培养皿的盖子，以免溶剂挥发）。

5.漂洗：将膜条从染色液中取出，在培养皿的边缘上沥去表面多余的染色液，

依次放入装有漂洗液的培养皿（共有2套）中漂洗2次（未漂洗时注意盖好培养皿

的盖子，以免溶剂挥发），至色带清晰的电泳图谱。

三、分析结果▲:

实验采用小牛血清故出现三条色带：清蛋白；四球蛋白；aa球蛋白，且清蛋

白颜色最深。

（本实验由于时间有限，授课时间安排首先由教师简单讲解实验步骤并向学生演

示操作方法后指导学生操作，在电泳的30min里教师给学生详尽讲解实验原理，

操作步骤及其注意事项。）

教学过程中师生活动设计

蛋白质颗粒为什么能电泳？依据什么性质？

提纲、板书设计

原理及简要操作步骤

1电.泳时，醋酸纤维薄膜点样的一端应靠近哪一极？为什么？

作业2血.清醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白依次分为哪几条区带？

主要[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013

参考资[2]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

料

1、需要强调点样方法，避免点样过多，重复点样等；

总结分

2、重点讲解迁移速率的因素；

析

3、结合血清电泳在医学检验领域的应用，便于学生更好的理解

《医学生物化学实验》教案

第9次课2学时

实验项血清ALT活性测定

目

实验性综合性实验

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质

教学目掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理、具体操作方法

的和要了解其临床意义。

求

教学重重点：血清谷丙转氨酶活性测定的原理。

点与难难点：血清谷丙转氨酶活性测定的方法。

点

试剂：O.lmol/L磷酸盐缓冲溶液、0.4mol/L氢氧化钠溶液、lmol/L氢氧化钠溶液、ALT底

实验材

物液、2,4-二硝基苯肺溶液、丙酮酸标准液。

料

材料：分光光度计、恒温水浴锅、试管、移液管、容量瓶、量筒。

一、实验原理★:

丙酮酸可与2,4-二硝基苯肿在酸性溶液中反应形成相应的2,4-二硝基苯腺，呈黄

色，后者在碱性条件下呈红棕色。通过测定其在520nm波长处的光吸收来了解丙酮酸的生

成量，借此测定血清ALT的活力，故该类方法又称比色测定法。该法虽然也有缺点，但

操作简便，不需要特殊仪器和试剂，故在临床上被广泛应用。

★该法的单位定义是：每1mL血清在pH7.4,37c保温条件下与底物作用30分钟，每

生成2.5%丙酮酸为一个单位。人血清的丙氨酸氨基转移酶正常值为2~40U«

二、实验步骤：

1.酶活反应体系的配制

试剂测定管测定对照管(2)标准管标准对照管

(1)(3)(4)

ALT底物(mL)0.50.50.5

37度保温5min(预热，可略)

血清(mL)