药学分生第二章的复制和修复

药学分生第二章的复制和修复

复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。第2页,共79页，2024年2月25日，星期天Reversetranscription中心法则图示第3页,共79页，2024年2月25日，星期天第一节DNA的复制第4页,共79页，2024年2月25日，星期天DNA复制是一个由多种酶催化和有多种蛋白质参与的受到精密调控的过程；

DNA是细胞中唯一具修复系统的生物大分子。第5页,共79页，2024年2月25日，星期天复制：以亲代（母链）DNA为模板合成子代DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA一、DNA复制的一般特征第6页,共79页，2024年2月25日，星期天（一）半保留复制

DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制第7页,共79页，2024年2月25日，星期天DNA复制可能的三种方式第8页,共79页，2024年2月25日，星期天半保留复制的证明：Meselson和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。第9页,共79页，2024年2月25日，星期天由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验的被誉为生物学最美丽的实验第10页,共79页，2024年2月25日，星期天Meselson和Stahl的证明DNA半保留复制的实验流程第11页,共79页，2024年2月25日，星期天15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度第12页,共79页，2024年2月25日，星期天第13页,共79页，2024年2月25日，星期天按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。半保留复制的意义第14页,共79页，2024年2月25日，星期天DNA复制的起点和方式复制起点：DNA复制总是从某一特定区域开始，这个特定区域是基因组内的一段特殊碱基序列，称为复制起点，ori或O不同生物有不同的复制起点，但都富含AT配对特征富含A·T配对的区域经常处于开发与闭合的动态平衡之中，称为DNA的呼吸作用。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。

第15页,共79页，2024年2月25日，星期天DNA复制起始区的特征第16页,共79页，2024年2月25日，星期天复制子（replicon）一个复制子只含有一个复制起点。两个相邻起始点之间的DNA片段，称为一个复制子。复制子是独立完成复制的功能单位。第17页,共79页，2024年2月25日，星期天AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA

复制过程中形成的复制叉子代DNA

复制叉第18页,共79页，2024年2月25日，星期天电镜下真核生物DNA的多个复制叉结构第19页,共79页，2024年2月25日，星期天复制叉的结构当DNA复制从起始区起动的时候，起始区的DNA双链因发生解链而形成叉状结构，这样的结构被称为复制叉

第20页,共79页，2024年2月25日，星期天大多数原核和真核生物复制时，DNA都是从固定起始点开始向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。复制方向（1）双向复制（bidirectionalreplication）（2）单向复制

从特定的位置开始，单方向进行复制。（3）不对称的双向复制第21页,共79页，2024年2月25日，星期天双向复制单向复制第22页,共79页，2024年2月25日，星期天（三）、半不连续复制

1、体内仅存在5’3’的DNA聚合酶

2、先导链与后随链（岗崎片段）第23页,共79页，2024年2月25日，星期天先导链后随链冈崎片段先导链：DNA复制时，一股以3’5’方向的母链作为模板，新合成的链以5’3’方向连续合成的链称为前导链。后随链：DNA复制时，一股以5’3’方向的母链作为模板，新合成链沿5’3’合成1000-2000个核苷酸不连续的小片段称为随从链。复制方向与解链方向一致复制方向与解链方向相反冈崎片段第24页,共79页，2024年2月25日，星期天

DNA半不连续复制：

3’5’方向母链为模板，新链5’3’方向连续合成5’3’方向母链为模板，新链5’3’方向合成许多不连续的片段（岗崎片段）这种复制方式称之为半不连续复制。第25页,共79页，2024年2月25日，星期天RNA引物

DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP在DNA模板上聚合需要具3’-OH的引物RNA聚合酶能催化两个游离NTP在DNA模板上聚合提供3’-OH引物最后被DNA聚合酶Ⅰ除去、补满，再由连接酶连接减少突变，提高DNA复制的真实性第26页,共79页，2024年2月25日，星期天发现（1968）：同位素实验，3HdT

短时间内为DNA小片段

一段时间后检测到DNA大片段。当用DNA连接酶的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。——证明DNA复制中有小片段合成。测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。由于U替代dT，被尿嘧啶-N-糖基酶切除。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。第27页,共79页，2024年2月25日，星期天二DNA复制的酶学1、使DNA链解离的酶解旋酶单链DNA结合蛋白DNA旋转酶（拓扑异构酶）第28页,共79页，2024年2月25日，星期天（1）解螺旋酶(helicase)（DnaB蛋白）：——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链（2）单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

E.Coli中的SSB以四聚体形式存在，与DNA结合具有协同作用。DNA复制的酶学————第29页,共79页，2024年2月25日，星期天108局部解链后（3）DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)

拓扑异构酶Π：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。第30页,共79页，2024年2月25日，星期天解链过程中正超螺旋的形成第31页,共79页，2024年2月25日，星期天此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。1、RNA引物酶：2、DNA复制过程中的酶第32页,共79页，2024年2月25日，星期天(2)DNA聚合酶：原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTPdCTPdTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3’-OH.合成方向：5

3

第33页,共79页，2024年2月25日，星期天

3’5’5’3’外切酶聚合酶NC5’3’外切酶小片段大片段（klenow片段）切除RNA引物损伤修复校读功能（常用的工具酶）1、DNA聚合酶Ⅰ聚合功能第34页,共79页，2024年2月25日，星期天已在大肠杆菌中发现5种不同的DNA聚合酶

DNAPI:占聚合酶总活性的90%DNAPII:

在DNA修复中起作用(1999年得到证明)DNAPIII:

主要的DNA复制酶

DNAPIV:

在DNA修复中起作用（在1999年发现）DNAPV:在DNA修复中起作用（在1999年发现）

DNA聚合酶家族第35页,共79页，2024年2月25日，星期天在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。其中，参与染色体DNA复制的是polα（延长滞后链）和polδ（延长前导链），参与线粒体DNA复制的是polγ，polε与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，polβ只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。

第36页,共79页，2024年2月25日，星期天参与DNA复制的酶与蛋白因子第37页,共79页，2024年2月25日，星期天（一）复制的起始（二）复制的延长（三）复制的终止三、DNA复制过程：第38页,共79页，2024年2月25日，星期天复制原点oriC和原点的识别：DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用oriC(或o）表示。大肠杆菌的复制原点oriC由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。第39页,共79页，2024年2月25日，星期天（一）复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白HU、ATP参与下，DanA蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿5’→3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。第40页,共79页，2024年2月25日，星期天第41页,共79页，2024年2月25日，星期天(二)链的延长（冈崎片段的合成）

真核生物的冈崎片段为：100-200bp原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp第42页,共79页，2024年2月25日，星期天DNA链的延伸

在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种5’-脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。

先导链后随链冈崎片段半不连续复制冈崎模型第43页,共79页，2024年2月25日，星期天冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:第44页,共79页，2024年2月25日，星期天(三)复制的终止顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致DNA复制的终止。第45页,共79页，2024年2月25日，星期天真核生物复制特点真核生物DNA复制与原核生物DNA复制的不同点：１．真核DNA有多个复制原点；2．真核生物有多种聚合酶。3．真核生物染色体为线性，末端具有端粒结构，由端粒酶合成4．真核生物染色体复制涉及核小体结构第46页,共79页，2024年2月25日，星期天从哺乳动物中分出５种DNApol酶。分别为polα、β、γ、δ、ε。Polα（4亚基）：有引物合成酶活性。具有合成RNA后4~5dNTP的活性。无外切酶活性。持续性中等，约为100核苷酸，完成滞后链DNA复制。Polδ（2亚基）：有持续合成DNA链的能力，有3'—5'核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前导链DNA复制。

Polε（>1亚基）：相当于E.coli的polⅠ，是一种修复酶，具有3

'→5'

核酸外切酶活性。Polβ（1亚基）：与损伤修复有关。Polγ（2亚基）：是线粒体DNA合成酶（3'→5'外切酶）

第47页,共79页，2024年2月25日，星期天四、特殊类型的复制（一）线粒体复制线粒体DNA双链闭环结构：重链、轻链取代环复制（D环复制）第48页,共79页，2024年2月25日，星期天D-环复制线粒体和叶绿体DNA通常以D-环的方式进行复制。少数病毒，如腺病毒，也进行D-环复制。催化线粒体DNA复制的酶是DNA聚合酶γ，两条链的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成冈崎片段，因此都是连续合成。两条子链的合成在时间上的不同步。第49页,共79页，2024年2月25日，星期天D环复制（displacement

replication）线粒体DNA的双股链分为轻链和重链。它的复制是一种单向不对称的特殊复制方式,称为Ｄ—环复制。复制从重链（Ｈ链）的原点开始，新合成的Ｈ链置换原来链，游离的单链称为取代链（displacement）或Ｄ环。当Ｈ链合成进行到约2/3时，轻链（Ｌ链）的原点暴露出来，并引发其合成，延伸方向与Ｈ链的相反。第50页,共79页，2024年2月25日，星期天D环复制

第51页,共79页，2024年2月25日，星期天（二）、噬菌体和病毒DNA的复制1.单链环状DNA病毒的复制1、第一阶段：以亲本单链（＋）为模板，合成互补链（－），形成闭合的双链环状复制形。2、第二阶段：滚环复制。一个负链可以合成许多正链，正链用于噬菌体包装。3´-OH5´-P3´-OH5´-P第52页,共79页，2024年2月25日，星期天2.线状DNA病毒的复制1、双链线状DNA的复制有两种起始类型：从DNA分子的中间起始从DNA分子末端起始腺病毒DNA的复制：从DNA分子末端起始，以单链置换形式进行。第53页,共79页，2024年2月25日，星期天图p116页第54页,共79页，2024年2月25日，星期天（2）、单链线状DNA的复制：微小病毒的复制图p118页第55页,共79页，2024年2月25日，星期天RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA3.逆转录病毒的复制：

从单链RNA到双链DNA的生成分三步第56页,共79页，2024年2月25日，星期天逆转录酶有三种活性：①RNA指导的DNA聚合酶活性；②RNase活性；③DNA指导的DNA聚合酶活性。第57页,共79页，2024年2月25日，星期天逆转录过程：①逆转录病毒RNA与宿主tRNA分子互补形成局部双链，以tRNA为引物，合成DNA负链5′端。②由RNaseH水解去除杂化双链中的RNA5′端。③新合成DNA负链的3′端跳到模板RNA的3′端，并通过两条链上共同的R序列形成杂交链。④DNA负链向5′端延伸。⑤RNaseH去除杂化双链中的绝大部分RNA。第58页,共79页，2024年2月25日，星期天⑦RNaseH去除RNA和tRNA引物。DNA正链的3′端跳到DNA负链的3′端，以两条链共有的PBS序列杂交，形成局部双链。⑨双向延伸完成DNA双链合成。⑥以剩余的一段RNA作引物合成DNA正链的3′端。第59页,共79页，2024年2月25日，星期天第60页,共79页，2024年2月25日，星期天

第二节、DNA的损伤与修复第61页,共79页，2024年2月25日，星期天（一）内源性损伤1.DNA复制错误：错配等2.碱基存在互变异构体，形成错误碱基配对3.自发的化学变化：脱嘌呤、脱氨基4.氧化作用损伤碱基一DNA损伤类型第62页,共79页，2024年2月25日，星期天（一）内源性损伤1、DNA的复制错误：复制错误引起损伤，在DNA损伤中最为多见。2、由于碱基本身存在互变异构体，可能形成错误的碱基配对。复制错误最多见于尿嘧啶（U）的渗入，另外偶有其它碱基的渗入。一DNA损伤类型第63页,共79页，2024年2月25日，星期天3、自发的化学变化：（1）脱嘌呤或脱嘧啶作用：是指DNA分子上丢掉了嘌呤碱或嘧啶碱，形成无碱基位点，称为AP部位(apyrimidine，apurinesite,AP)。在生理状态下，脱嘌呤是脱嘧啶的20倍。（2）脱氨基作用：即胞嘧啶、腺嘌呤及鸟嘌呤的环外氨基自发丢失。

胞嘧啶→尿嘧啶；腺嘌呤→次黄嘌呤；鸟嘌呤→黄嘌呤。脱氨基所至的碱基转变可影响DNA的复制，由此产生突变。第64页,共79页，2024年2月25日，星期天4、氧化作用损伤碱基：代谢产生活性氧基团，使DNA氧化损伤第65页,共79页，2024年2月25日，星期天（二）外源性损伤物理因素化学因素紫外线损伤（共轭双键）电离辐射损伤（X线/

线）亚硝酸盐CU5-溴尿嘧啶5-BUA氮芥类烷化剂羟胺C-AGG羟胺第66页,共79页，2024年2月25日，星期天

物理因素：由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。

第67页,共79页，2024年2月25日，星期天

化学因素：碱基类似物：5-BU,齐多夫定……碱基修饰剂：亚硝酸、烷化剂……第68页,共79页，2024年2月25日，星期天二DNA损伤在药物评价中的应用遗传毒性试验：检测DNA损伤以及损伤的固定多种方法组合实验第69页,共79页，2024年2月25日，星期天诱变育种常用诱变剂：射线、烷化剂、碱基类似物、移码突变剂等三DNA损伤与抗生素菌种诱变第70页,共79页，2024年2月25日，星期天在长期的进化过程中，生物体演化出了一整套十分有效的DNA损伤修复系统，包括：①纠正偶然复制错误的系统——复制修复DNA聚合酶的3´→5´校读功能DNA糖苷酶修复系统错配修复系统等第三节DNA修复③复制后修复：主要包括重组修复系统、SOS修复系统。②修复环境因素致DNA损伤的系统——损伤修复主要包括：光修复系统、切除修复系统第71页,共79页，2024年2月25日，星期天1、尿嘧啶糖苷酶修复系统：

对于纠正复制错误尤为重要。ATCGAGTTAGCUCAATCGAGTTAGCCAATCGAGTTAGCCAATCGAGTTAGCTCA尿嘧啶糖苷酶UAP内切酶连接酶外切酶修复