蛋白质的定性定量分析课件

蛋白质的定性定量分析课件

蛋白质定性分析

(qualitativeanalysis)

确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质

蛋白质定量分析

(quantitativeanalysis)

确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量第2页,共35页，2024年2月25日，星期天

蛋白质含量的测定方法（重点掌握）

蛋白质相对分子量测定(SDS)

等电聚焦电泳(IEF)（一般了解）

蛋白质的免疫印迹分析

(westernblotting)第3页,共35页，2024年2月25日，星期天第一章蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定基于蛋白质的元素组成特点基于蛋白质的化学显色反应基于蛋白质的光吸收特性第4页,共35页，2024年2月25日，星期天

蛋白质元素组成的特点各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%第5页,共35页，2024年2月25日，星期天一、紫外光谱(A280)吸收法

这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰第6页,共35页，2024年2月25日，星期天原理

色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近

大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收第7页,共35页，2024年2月25日，星期天所需时间几分钟优点快速缺点核酸可引起强干扰作用灵敏度

0.2mg/ml～2mg/ml对蛋白质无破坏性不是严格的定量，适用于测定蛋白质粗提液第8页,共35页，2024年2月25日，星期天计算方法标准曲线法蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事项石英比色杯调零所用溶液配制标准蛋白所用溶液光密度范围第9页,共35页，2024年2月25日，星期天二、Bradford检测法

这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法第10页,共35页，2024年2月25日，星期天原理

该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595mn的光吸收值大小计算蛋白的含量第11页,共35页，2024年2月25日，星期天所需时间

10min优点快速（反应时间仅需2min）敏感，几乎没有蛋白质损失缺点用这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性灵敏度

25ug/ml～200ug/ml对各种纯化蛋白质反应不同第12页,共35页，2024年2月25日，星期天计算方法标准曲线法注意事项标准曲线在2.5ug～15ugBSA浓度范围内保持线性关系反应10～15min后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条件下易发生沉淀若选用目的蛋白来做标准曲线或用另一种方法来校正，所测蛋白浓度较准确第13页,共35页，2024年2月25日，星期天三、Lowry检测法

这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用，在检测之前可通过蛋白质沉淀将干扰物质去除第14页,共35页，2024年2月25日，星期天原理

首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745～750nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量第15页,共35页，2024年2月25日，星期天所需时间

40min优点一种可靠的蛋白质定量方法不同蛋白质之间差别很小缺点某些试剂不稳定灵敏度

5ug/ml～100ug/ml干扰物质多反应速度慢使蛋白质发生不可逆变性第16页,共35页，2024年2月25日，星期天计算方法标准曲线法注意事项在加入试剂30min后呈色达到饱和，时间延长颜色信号减弱许多干扰物质降低颜色反应高盐浓度可引起沉淀第17页,共35页，2024年2月25日，星期天四、BCA(二喹啉甲酸)检测法

这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质的影响第18页,共35页，2024年2月25日，星期天原理

在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量第19页,共35页，2024年2月25日，星期天优点与Lowry法相比几乎没有干扰物质的影响缺点蛋白质发生不可逆的变性灵敏度标准检测：10～1200ug/ml单一试剂终产物稳定反应时间长微量检测：0.5～10ug/ml第20页,共35页，2024年2月25日，星期天计算方法标准曲线法注意事项与Lowry相比，采用BCA法时，如果样品中含有脂类物质将明显提高光吸收值为促进BCA法的反应进程，可将样品适当加热第21页,共35页，2024年2月25日，星期天小结（Summary）掌握常用的测定方法不同方法的操作步骤操作过程的注意事项第22页,共35页，2024年2月25日，星期天其它蛋白质的定性定量方法1.蛋白质的染色定量2.ELISA测定3.放射免疫测定第23页,共35页，2024年2月25日，星期天第二节蛋白质相对分子量测定分子量测定(molecularweight,MW)排阻层析沉降平衡超速离心动态弹性光散射孔径梯度电泳质谱(ESI-MS)第24页,共35页，2024年2月25日，星期天一、SDS测定蛋白质的相对分子量1.不连续系统原理2.SDS凝胶的制备制备分离胶制备浓缩胶加样装板电泳卸板并进行凝胶染色SDS第25页,共35页，2024年2月25日，星期天3.SDS基本原理

SDS

影响迁移率的因素

十二烷基硫酸钠

(sodiumdodecylsulfate)

十二烷基磺酸钠

(sodiumdodecylsulfate)

第26页,共35页，2024年2月25日，星期天

SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大于1mmol/L时，SDS与蛋白质的结合比例为1.4gSDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异第27页,共35页，2024年2月25日，星期天

SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的荷质比，因此在SDS中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系WatchSDS原理第28页,共35页，2024年2月25日，星期天4.SDS测定分子量的操作标准品的选择及处理待测样品的制备电泳分离及染色相对迁移率的计算WatchSDS操作第29页,共35页，2024年2月25日，星期天AnalysisforSDSelectrophoresis第30页,共35页，2024年2月25日，星期天5.注意事项选择合适的胶浓度样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去

SDS与蛋白质之间的结合程度蛋白质的分子量范围15～200KD之间二硫键是否完全被还原溶液中SDS的浓度溶液的离子强度第31页,共35页，2024年2月25日，星期天多亚基蛋白质分子量检测用其它方法测定分子量进行参照

SDS和巯基乙醇

SDS测定的准确性电荷异常或构象异常带有较大辅基的蛋白质某些结构蛋白第32页,共35页，2024年2月25日，星期天二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量1.基本原理2.凝胶过滤测定分子量的操