发育毒性与致畸作用

关于发育毒性与致畸作用[主要内容]1.发育毒性和致畸作用的基本概念2.发育毒性和致畸作用的特点和影响因素3.发育毒性的剂量-反应模式4.母体毒性与发育毒性5.发育毒性和致畸作用常用评价方法:动物发育毒性试验、流行病学研究、替代试验。

第2页,共93页，2024年2月25日，星期天第一节概述

一、发育毒理学（developmentaltoxicology）：是毒理学的重要分支学科，是研究发育生物体在受精卵、妊娠期、出生后、直到性成熟的发育过程中，由于出生前暴露于环境有害因子导致的异常发育结局及有关的作用机制、发病原理、影响因素和毒物动力学等。第3页,共93页，2024年2月25日，星期天畸胎学（古代）现代实验畸胎学（19世纪）发育毒理学第4页,共93页，2024年2月25日，星期天从畸胎学到发育毒理学

畸胎学(Teratology）作为一个描述性的科学在有文字之前就已经存在了。最早可以追溯到6500D.B。杂交理论（Hybridetheory）认为畸形是人和动物杂交的结果并且这种杂交动物广泛存在于神话传说中，如人头马身怪物、人头牛身等。第5页,共93页，2024年2月25日，星期天现代实验畸胎学：始于19世纪，研究者注意到作用时间在决定畸形类型方面比损伤的性质更重要。

从畸胎学到发育毒理学物理（震动、倒置、针刺）化学因素鸡蛋畸形小鸡神经管缺陷、无脑畸形、脊柱裂、独眼畸形、心脏缺陷、位置颠倒、联体双胞胎等。第6页,共93页，2024年2月25日，星期天致畸研究简史第7页,共93页，2024年2月25日，星期天

反应停（thalidomide）事件孕妇的理想选择？1953年，联邦德国一家名为ChemieGruenenthal的制药公司研究人员发现，镇静安眠药反应停对孕妇怀孕早期的妊娠呕吐疗效极佳。1957年10月1日该公司将反应停正式推向市场。第8页,共93页，2024年2月25日，星期天

反应停便成了“孕妇的理想选择”（当时的广告用语），此药在欧洲、亚洲、非洲、澳洲和南美洲被医生量处方给孕妇以治妊娠呕吐。科学家们在研制反应停时并没有料到这种药物会产生如此可怕的副作用。第9页,共93页，2024年2月25日，星期天令人恐怖的副作用到了1960年，欧洲的医生们开始发现，本地区畸形婴儿的出生率明显上升。这些婴儿有的是四肢畸形（主要是双上肢的短肢畸形），还有的是腭裂、盲儿、聋儿或内脏畸形。第10页,共93页，2024年2月25日，星期天西德的Lenz和澳大利亚的McBride两人同时于1961年分别独立确认反应停为诱发短肢畸形的病因。反应停被迫从市场撤回，动物模型复制成功。其致畸剂量为1mg/(kg.d)，只要末次月经后6~8周内口服200mg反应停便可引起严重的短肢畸形；服药妇女还有流产、早产和死胎等发生。(孕妇的口服剂量是50-200mg/d)据推算，当时全世界有7000~10000畸形儿是由反应停所致。第11页,共93页，2024年2月25日，星期天服用过量维生素引起的畸形维生素A每日服用5万单位（相当于浓缩A丸剂2丸、或浓缩鱼肝油滴剂30滴），连续3个月，会使胎儿骨骼畸形、并指、腭裂、眼与脑畸形、肾及中枢神经损害。第12页,共93页，2024年2月25日，星期天酒精胎儿综合征第13页,共93页，2024年2月25日，星期天上述事件让人们逐渐认识到生物、物理、化学因素和不良生活嗜好都可引起人类畸形；尤其是反应停事件的发生，大大推动了外源化学物致畸作用和发育毒性的研究及新药发育毒理学研究和管理法规的建立。第14页,共93页，2024年2月25日，星期天悲剧带来的福音！1966年美国食品与药品管理局（FDA）提出三段生殖毒性试验指南，其中包括对致畸等发育毒性的评价。1986年美国环保局（EPA）提出可疑发育毒物危险度评价指南，第一次明确提出要对化学物进行发育毒性评价。从20世纪70年代起，我国已开始了对药品、农药、食品添加剂和环境污染物的致畸研究，并把致畸试验、生殖毒性试验列为新药、农药、食品及首次进口化学品的安全性毒理学评价的重要组成部分。第15页,共93页，2024年2月25日，星期天

第二节发育毒性与致畸性一、基本概念

畸形（malformation）：指发育生物体解剖学上形态结构的缺陷。对外观、生理功能和（或）寿命等可产生有害影响，可以存活也可能死亡。

致畸物（teratogen）:

致畸作用（teratogeniceffect）:致畸性（teratogenicity）:第16页,共93页，2024年2月25日，星期天第17页,共93页，2024年2月25日，星期天第18页,共93页，2024年2月25日，星期天第19页,共93页，2024年2月25日，星期天第20页,共93页，2024年2月25日，星期天第21页,共93页，2024年2月25日，星期天是由遗传和遗传外因素控制的外观变化，或由于分化改变而引起的差异。指在同一种属的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象。例如肋骨或椎骨数目多于或少于正常，甚至某些内脏易位都属于变异。

2.变异第22页,共93页，2024年2月25日，星期天一般认为变异不影响正常生理功能，更不危及生命。但是在动物致畸试验中，如果某种变异出现较多，并呈一定剂量——效应关系，应该引起注意。2.变异第23页,共93页，2024年2月25日，星期天广义上包括孕体结构和功能方面的各种损害，狭义指孕体的死亡和生长发育迟缓，不包括结构畸形。区分胚体和胎体两个阶段；每个阶段损害的主要特点。3.胚体-胎体毒性(embryo-fetaltoxicity)第24页,共93页，2024年2月25日，星期天指出生前后接触有害因素，子代个体发育为成体之前诱发的有害影响，主要表现为：发育生物体死亡生长改变结构异常功能缺陷

4.发育毒性（developmentaltoxicity）第25页,共93页，2024年2月25日，星期天

发育毒性的主要表现发育生物体死亡：包括受精卵未发育即死亡；胚泡未着床即死亡（早早孕丢失）；着床后发育到某一阶段死亡。早期死亡被吸收或自子宫排出（自然流产）；晚期死亡成为死胎。第26页,共93页，2024年2月25日，星期天

发育毒性的主要表现生长改变（alteredgrowth）:生长迟缓，生长发育指标低于正常对照的均值2个标准差。结构异常（structuralabnormality）:指胎儿形态结构异常，即畸形。功能缺陷（functionaldeficiency）:即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。第27页,共93页，2024年2月25日，星期天5.出生缺陷（birthdefect):指婴儿出生前即已形成的发育障碍，包括畸形和功能缺陷。如先天性心脏病、唇腭裂、神经管畸形、尿道下裂、隐睾症等。6.不良妊娠结局（adversepregnancyoutcomes)：指妊娠后不能产生外观和功能正常的子代。第28页,共93页，2024年2月25日，星期天二、发育毒性的作用特点和影响因素与对其他器官系统的毒性作用相比，外源化学物的发育毒性作用有显著的特点:致畸作用受到多种因素的影响，包括敏感期、遗传类型、剂量、母体毒性等。第29页,共93页，2024年2月25日，星期天（一）发育各阶段发育毒性作用特点和致畸敏感期卵子受精后一直发育直至出生为止，都称为孕体。从受精到新生儿的发育过程经历着:着床前期器官形成期

最容易引起畸形的阶段胎儿期围生期和出生后的发育期第30页,共93页，2024年2月25日，星期天1.着床前期又称为分化前期，从受精时算起，到完成着床之前。该期限在人类为11-12天；啮齿动物为前6天。这时受损伤的胚泡容易死亡，称为着床前丢失。有些化学毒物作用于胚泡，使之死亡而丢失。第31页,共93页，2024年2月25日，星期天着床前期发育毒性

一般认为，此时很少发生特异的致畸效应。也有着床前期接触毒物导致胎儿畸形的例子。如：

甲基亚硝脲

子代神经管缺陷小鼠妊娠第2.5天、3.5天和4.5天

腭

裂

第32页,共93页，2024年2月25日，星期天孕体着床后直到硬腭闭合的一段时间。是发生结构畸形的关键期(criticalperiod)，也称致畸敏感期。在此期间，大多数器官对致畸作用有特殊敏感期，即所谓的时间“靶窗”（targetwindow）。自受精之日计算：人是3-8周；大、小鼠是6~15天；家兔为6~18天。2.器官形成期第33页,共93页，2024年2月25日，星期天第34页,共93页，2024年2月25日，星期天同一剂量的一种致畸物在敏感期与胚胎接触，可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形。Case1：大量维生素A在受精后第8天给予大鼠，主要出现骨骼畸形；在第12天给予，则诱发腭裂。case2：同样剂量砷酸钠在小鼠受精第7天和第9天分别给予，前者主要出现脐疝，后者主要为露脑。器官形成期发育毒性第35页,共93页，2024年2月25日，星期天Rodentdevelopment第36页,共93页，2024年2月25日，星期天在器官形成期，染毒除致畸外，也可能引起胚胎死亡。人和灵长类以流产告终，一胎多仔动物胚胎死亡后被吸收，称为吸收胎。在这一时期，外源化学物表现出发育毒性，以结构畸形最突出，也可有胚胎死亡、生长迟缓。器官形成期发育毒性第37页,共93页，2024年2月25日，星期天

器官形成结束后（人类从第56-58天起）到分娩的一段时间。

以组织分化，生长和生理学的成熟为基本特征，接触发育毒物很可能对生长和功能成熟产生效应。

全身生长迟缓特异的功能障碍经胎盘致癌死胎3.胎儿期第38页,共93页，2024年2月25日，星期天发育毒性的主要表现：发育免疫毒性神经行为发育异常儿童期肿瘤4.围生期和出生后的发育期第39页,共93页，2024年2月25日，星期天围生期和出生后的发育毒性

发育免疫毒性二噁英、氯氰菊酯、乙醇等→影响出生后T细胞、B细胞和吞噬细胞的发育、分化、迁移、归巢和功能。最终暂时或永久性损害子代的免疫系统。第40页,共93页，2024年2月25日，星期天围生期和出生后的发育毒性发育神经毒性表现为对感觉、运动、自主和认知的影响。妊娠期饮酒→乙醇综合征胎儿（FAS）。父母亲吸烟（烟碱）可改变胎儿中枢神经系统烟碱受体发育，增加出生后的学习、行为和注意力障碍。第41页,共93页，2024年2月25日，星期天围生期和出生后的发育毒性

儿童期肿瘤围生期是一生中对致癌物最敏感的时期，许多儿童期高发肿瘤（如急性淋巴细胞性白血病、神经母细胞瘤、骶骨前畸胎瘤等）都可能与出生前因素有关。因为这一时期细胞增殖快，药物代谢酶的个体发生不全，免疫监视功能低。第42页,共93页，2024年2月25日，星期天

发育各阶段发育毒性的重要表现

发育阶段

重要表现

着床前期

胚胎死亡

器官形成期

畸形、胚胎死亡

胎儿期

生长迟缓、功能不全、胎儿死亡、经胎盘致癌新生儿期生长迟缓、神经系统、免疫系统功能不全、儿童期肿瘤第43页,共93页，2024年2月25日，星期天（二）发育毒性的剂量-反应模式除了在较高剂量几乎全窝胚胎死亡外，正常胎、生长迟缓和结构畸形同时存在：这一类型较常见。在远远低于胚胎致死的剂量下即可出现致畸，甚至全窝致畸：这种模式表示受试物有高度致畸作用，较少见。只有生长迟缓和胚胎致死，但没有畸形发生。第44页,共93页，2024年2月25日，星期天发育毒性的阈值概念需要极大的样本数，难以用实验找出一个发生率很低的剂量-反应关系；多数发育毒性机制还不清楚，或支持或不支持阈值的存在；考虑个体的阈值和群体的阈值之间的区别。第45页,共93页，2024年2月25日，星期天（三）发育毒性的物种差异Species

Humans 0.5mg/kg/day

Mouse 30 60X

Rat 50 100X

Dog 100 200X

Hamster 350 700XDose

(LETD)FoldDifferencefromHumansCross-SpeciesDifferencesin

Response

toThalidomide

第46页,共93页，2024年2月25日，星期天三、母体毒性与发育毒性

母体毒性（maternal

toxicity）：指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症状、直至死亡。（一）母体因素对发育毒性的影响

遗传学、疾病、营养、应激、对胎盘的毒性

第47页,共93页，2024年2月25日，星期天（二）母体毒性与胚胎毒性的关系1．具有发育毒性，但无母体毒性；2．同时出现发育毒性和母体毒性；3．具有母体毒性，但不具有致畸作用；4．在一定剂量下，既无母体毒性，也不表现发育毒性。第48页,共93页，2024年2月25日，星期天

第四节

发育毒性和致畸作用试验与评价

外源化学物发育毒性的评价动物发育毒性试验人群流行病学调查发育毒性替代试验第49页,共93页，2024年2月25日，星期天动物发育毒性试验优点：

容易控制接触条件、接触动物数量、年龄、状态及选择检测效应指标（终点）。甚至一些轻微的效应对研究人体影响很有意义。缺点：试验结果外推到人存在不肯定性，预测对人的致畸性特异性不够高；从较高剂量暴露结果外推到人（暴露剂量较低）有一定困难，况且人与人之间的个体差异要比动物的更大。第50页,共93页，2024年2月25日，星期天一、动物发育毒性试验主要的试验方案1.三段生殖毒性试验主要用于评价药物的生殖发育毒性。2.一代和多代生殖毒性试验主要用于评价食品添加剂、农药及其他化学物的生殖发育毒性。3.改进的大鼠发育神经毒性的试验程序：1988年EPA发布。第51页,共93页，2024年2月25日，星期天最佳方案是对成年动物进行染毒并试验，包

括子代从受精卵到性成熟所有生长发育阶段；观察期应贯穿一个完整的生命周期。

设计的关键在于试验对生殖和生长发育各阶段的影响无间隔，并可直接或间接评价生殖循环的全过程。最常选用的方案为三段生殖毒性试验。动物发育毒性试验的基本要求第52页,共93页，2024年2月25日，星期天为了进行生殖发育毒性实验设计方便，将连续、完整的生殖发育过程细分为以下6个阶段：交配性成熟第53页,共93页，2024年2月25日，星期天三段生殖毒性实验示意图

I

生育力与早期胚胎发育毒性试验;II胚体－胎体毒性试验；III出生前和出生后发育毒性试验。实线表示染毒期。处死怀孕前着床前器官形成期胎期新生儿期

开始怀孕着床分娩断乳I4周15天处死♂♀IIIII第54页,共93页，2024年2月25日，星期天生育力与早期胚胎发育毒性试验流程图第55页,共93页，2024年2月25日，星期天胚胎-胎仔发育毒性试验流程图第56页,共93页，2024年2月25日，星期天围产期毒性试验流程图第57页,共93页，2024年2月25日，星期天致畸试验致畸作用是发育毒性中最重要、最容易观察到一种表现，故化学物发育毒性的评定主要通过致畸试验。在致畸试验中除可观察到出生幼仔畸形外，也可同

时发现生长发育迟缓和胚胎致死。Ⅱ段试验是评定化学物是否具有致畸作用的标准方法。第58页,共93页，2024年2月25日，星期天动物选择:一般要求选用两种哺乳动物啮齿类：首先考虑大鼠，也可采用小鼠。非啮齿类：多选家兔。致畸试验第59页,共93页，2024年2月25日，星期天剂量分组试验剂量组最少应设三个剂量组：高、中、低。每组剂量成等比级数关系。另设对照组。原则上高剂量组可引起母体轻度中毒；中剂量组可允许母体出现某些极轻微中毒症状；最低剂量组不应观察到任何中毒症状。致畸试验第60页,共93页，2024年2月25日，星期天动物交配将性成熟雌雄动物按雌雄1：1或2：1比例同笼交配，每日通过阴栓或阴道涂片精子检查，将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。出现阴栓或精子之日即为受孕第1天。致畸试验第61页,共93页，2024年2月25日，星期天动物染毒染毒时间：在器官形成期，即从着床期到硬腭闭合大、小鼠孕期的第6~15天兔孕期的6~18天。染毒方式与途径应与人体实际接触情况一致一般多经口给予。致畸试验第62页,共93页，2024年2月25日，星期天染毒期间观察妊娠动物的：体征和死亡（1次/日）;体重和体重改变（2次/日）；摄食量（1次/日）；其他毒性研究中已证实的重要靶效应。致畸试验第63页,共93页，2024年2月25日，星期天胎体检查：自然分娩前1~2天将受孕动物处死：一般大鼠在受孕后第19~20天；小鼠第18~19天；家兔在第29天。致畸试验第64页,共93页，2024年2月25日，星期天剖腹处死时对所有妊娠动物进行尸体解剖和肉眼检查。保存肉眼发现有改变的脏器，以便进行组织学评价。取出子宫及活产胎体，并另行记录死胎和吸收胎。活胎取出后，先检查性别，逐只称重，并按窝计算平均体重，然后由下列几方面进行畸形检查：外观畸形内脏及软组织畸形骨骼畸形。畸形检查只限活产胎体。致畸试验第65页,共93页，2024年2月25日，星期天以上检查只能检出结构与形态的畸形，不能检出可能发生的生化功能或神经行为缺陷。故为了全面了解可能存在的先天缺陷和生理功能异常，可将试验雌鼠保留1/4左右待其自然分娩，饲养观察出生幼仔以便检查。致畸试验第66页,共93页，2024年2月25日，星期天结果评定：对母体毒性的评价指标：体重、体重变化、食物和水消耗量、死亡率、交配率、受孕率、脏器重及母体畸胎出现率等。致畸试验第67页,共93页，2024年2月25日，星期天结果评定：对孕体影响的评价指标：着床数、黄体数、平均胎体体重/窝、活胎数/窝、吸收胎数/窝、畸胎数/窝等。致畸试验第68页,共93页，2024年2月25日，星期天结果评价发育毒性的剂量-反应关系比较复杂。随着剂量增加，先出现发育迟缓，然后胚胎-胎儿死亡和畸形发生，剂量很大时可致全部死亡。试验最后应能得出受试物对母体和胚胎-胎儿各自的NOAEL和LOAEL。为了比较不同化学物的致畸强度，可计算致畸指数：致畸试验第69页,共93页，2024年2月25日，星期天致畸指数=

评定标准：

致畸指数在10以下不致畸；10-100为致畸；100以上为强致畸。第70页,共93页，2024年2月25日，星期天动物实验结果外推到人的问题动物实验中所见发育毒性的类型，不一定与人所产生的一样；发育毒性的所有表现（死亡、生长迟缓、结构异常和功能缺陷），与人都是有关系的，不应仅注意结构异常；人在孕期中摄入量不太小的物质，只要对实验动物产生发育毒性，就表示对人是一种潜在危害。第71页,共93页，2024年2月25日，星期天发育毒性和致畸作用试验与评价（二）流行病学研究用流行病学的方法研究环境中的生殖毒物对人群生殖、发育影响的情况，包括性质，程度以及原因。环境流行病学研究必须配合以环境化学毒物的检测和人体生物标志物的检测即分子流行病学研究。环境流行病学研究不是一般的流行病学调查，须科学设计、严格选择对象和对照，观察指标客观量化。第72页,共93页，2024年2月25日，星期天

(1)在某些罕见的病例中，可能不需要正式研究就可以识别异常出生结局的原因。

(2)对老污染物或老产品只能采用回顾性或横断面调查，这类调查较难获得明确的结论。

需要足够大的效应和研究人群。

在出生时异常结局的发生率不能反映异常的真实比率。3.病例报告和出生缺陷监测登记对获得人类的发育毒性证据是有用的。

流行病学研究第73页,共93页，2024年2月25日，星期天确认人类致畸物的标准：一种特殊的缺陷或几种缺陷并发（综合征）的频率突然增加。缺陷的增加与某种已知的环境改变（如一种新药的广泛使用）相关联。在妊娠的特殊阶段已知暴露于某种环境的改变，产生有特征性缺陷的综合征。缺少妊娠时引起特征性缺陷婴儿的其他共同的因子。第74页,共93页，2024年2月25日，星期天致畸化学物的分类

国际生命科学研究所（InternationalLifeScienceInstitute,ILSI）：根据动物试验中发育毒性的类型、严重程度和发生率，分为4级ICH人类用药危险性分类：分为5类，供临床医师参考美国FDA：根据药物对人孕体造成危害的证据，分为5类欧洲致畸物危险度分级分类标准，分5级WHO:全球化学品统一分类和标签制度（GHS）致畸指数＝母体LD50/胎体最小致畸剂量。<10一般不致畸,10~100为致畸,>100为强致畸第75页,共93页，2024年2月25日，星期天致畸化学物的分类（ILSI,1989）第76页,共93页，2024年2月25日，星期天妊娠期用药类型（ICH）

A、B、C2：仅在明显需要时，妊娠期间可以使用C1：仅在如果证明可能效益与对胎儿的可能危险比较可取时，妊娠期间可以使用D：如果在妊娠期间使用，应通知病人对胎儿可能的危害X：在妊娠期间或可能妊娠的妇女中禁止使用第77页,共93页，2024年2月25日，星期天发育毒性的初筛和替代试验体外初筛试验体内初筛试验第78页,共93页，2024年2月25日，星期天体外初筛试验随着细胞、组织和器官培养技术的进步，发展了一些发育毒物体外初筛试验，建立了全胚胎培养、器官培养和细胞培养的体外试验法。这些试验方法的结果与没有母体毒性的整体动物致畸试验有较好的相关，且可严格控制实验条件，故可用这些试验作发育毒物的初筛，预测对整体动物的致畸性，发现致畸作用的靶器官，或阐明致畸机制等。第79页,共93页，2024年2月25日，星期天常见的体外初筛试验有：大鼠全胚胎培养器官培养细胞培养法体外初筛试验第80页,共93页，2024年2月25日，星期天大鼠全胚胎培养自从１９７８年首次在体外进行啮齿类动物全胚胎培养成功后，这一技术逐渐被应用于毒理学研究。用于着床后全胚胎培养的胚体正处于器官发生期，是对有毒外源物高度敏感的发育阶段，能较好的反映化学物对胚体的影响。该方法在毒理学、药理学等领域被广泛应用，但本法技术难度相对较大，费用高。第81页,共93页，2024年2月25日，星期天大鼠全胚胎培养具体试验方法；从孕期9～10天大鼠子宫取出胚体，剥去Reichert膜，放入培养液中加入外源化学物，在孵箱中通气旋转培养。观察心脏搏动、卵黄囊直径、胚芽、神经管闭合、体节数目及体长等发育情况。根据Brow评分对器官形态分化做出评价。可筛选受试化学物的发育毒性、探讨其剂量反应关系和作用机制。第82页,共93页，2024年2月25日，星期天器官培养是将胚体或胚体组织、器官或器官的一部分在体外培养，观察化学物对其发育过程的影响。常选用胚体肢芽、腭板、晶状体、肾、肺、肝、牙等组织器官进行培养。其中以肢芽培养系统在方法学上较为完备。第83