【乌兰三味汤散有效成分检测方法探究进展综述6700字】

乌兰三味汤散有效成分检测方法研究进展综述目录TOC\o"1-2"\h\u4184乌兰三味汤散有效成分检测方法研究进展综述 129525引言 1216961.乌兰-3有效成分及药理作用 1185091.2紫草茸有效成分及药理作用 1167501.3茜草有效成分及药理作用 2187201.4枇杷叶有效成分及药理作用 2198332.检测方法 3204952.1乌兰-3有效成分体外检测方法研究 3132112.2乌兰-3有效成分体内检测方法研究 4144623.总结 517753.1全文总结 53173.2今后的发展与展望 510914参考文献 6摘要：乌兰-3是蒙医传统名方，出自蒙医经典著作《诊治名医典》也称“玛日布-3音汤”、“三红汤”。由紫草茸、茜草、枇杷叶三味药材等量研磨制成。但现有的成方制剂无明确可靠的质量标志物，现有质量标准中选择的定量成分代表性差，有效成分不明。本文通过查阅相关文献，从乌兰-3有效成分的研究及检测方法两个方面对其进行综述，为乌兰-3的体内吸收和作用机制的相关研究提供参考。结论：研究乌兰-3的有效成分有什么检测方法，对比不同的有效成分检测方法，发现高效液相色谱-质谱联用技术既可以进行体外检测也可以进行体内检测，操作简单，准确性高，适用于乌兰-3有效成分的检测。关键词：乌兰-3；有效成分；检测方法；研究进展引言乌兰-3现有的成方制剂和医院制剂均为将三种药物等量研磨，用水煎煮后服用，称之为“汤散”，临床用于治疗过敏性紫癜[1-3]、紫癜性肾炎[4,5]、糖尿病及相关病症[6,7]、尿路感染[8]、银屑病[9]、布鲁氏菌病[10]等。现有临床上对于乌兰-3的用法主要有三种，与其他药物合用，作为药引子使用和单独使用。因此，现有质量标准中选择的定量成分代表性差，限制了临床推广应用及后续科学规范的研究。综上，本文就乌兰-3有效成分检测方法的研究进行综述，为乌兰-3的后续剂型开发与优化，药动学，药效学和临床用药提供参考。乌兰-3有效成分及药理作用1.2紫草茸有效成分及药理作用紫草茸为胶蚧科动物紫胶虫(LacciferlaccaKerr)在树枝上所分泌的干燥胶质。具有清热，凉血，解毒之功效。用于麻疹，疮疡，湿疹等。卢禁等[11]采用开放硅胶柱色谱、ODS、HPLC等方法分离化合物，运用现代波谱技术确定化合物的结构。结果从紫胶甲醇提取物中分离纯化得到5个蒽醌类化合物，分别鉴定为红紫胶素(Erythrolaccin)，1,3,4,6-四羟基-8-甲基蒽醌，去氧虫胶红素，2,3,5,6-四羟基-8甲基蒽醌，胭脂红素。紫草茸的功效与作用主要有清热，凉血，解毒。治麻疹、斑疹不易透发，产后血晕，带下，疮疥肿毒。《唐本草》：主五脏邪气，带下，心痛，破积血，金疮生肉。;《海药本草》：治湿痒疮疥，宜入膏用。;《中药志》：治斑疹不透，麻疹不出。1.3茜草有效成分及药理作用茜草（RubiacordifoliaL.）为茜草科植物茜草的干燥根和根茎，含有蒽醌类、萘醌类、萜类、环己肽类、β-谷甾醇、胡萝卜甙木糖东莨菪素、蔗糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、粗酶、蜗牛酶、纤维素酶、γ-淀粉酶、β-葡萄糖甙酶、柠檬酸、苹果酸、酒石酸及脂肪酸化合物。性凉、涩、钝、柔、燥；有清伤热和血热，止血和止泻，镇咳，抗炎，抗感染等功效[12]。有研究表明茜草根煎剂含有茜草素，能同血液内钙离子结合，产生抗凝效应[13]。吴彩霞等[14]采用了7H10琼脂培养基，来动态观察三种醌类化合物（蒽醌、对二苯酚和大叶茜草素）对H37Rv的抑制作用，从而显示出了大叶茜草素对H37Rv有抑菌活性。冯秀香等[15]用热板法、电刺激法、扭体法来测定了茜草总蒽醌对小鼠痛阈值的影响，和对伤寒菌苗所致发热家兔的解热作用。结果显示，茜草总蒽醌能明显提高侯小鼠各时间组的痛阈值，并降低伤寒菌苗所致发热家兔的体温，具有较强的解热镇痛作用。侯滔等[16]采用了HT-29细胞培养，以其高表达的GPR35受体为靶标，通过无标记细胞靶点药理学技术检测羟基茜草素对GPR35受体的激动活性，而GPR35受体与疼痛、炎症和肿瘤等疾病相关。1.4枇杷叶有效成分及药理作用枇杷叶为蔷薇科植物枇杷(Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.)的干燥叶。主要含三萜酸、挥发油、黄酮、多酚类、机酸类、多糖类、以及皂苷、鞣质及维生素B1等多种有效成分。本品味苦，性凉、钝。现代药理研究表明其有清热，祛痰，止咳，抗炎、抗肿瘤等作用，多用于肺热咳嗽，气管炎、肾脏及膀胱热，尿路感染、月经不调及口腔疾病等。王立为等[17]用枇杷叶不同分离部分及单体成分分别干预二甲苯致小鼠耳肿胀、二氧化硫引起小鼠咳嗽和枸椽酸喷雾致豚鼠咳嗽模型，发现枇杷苷、乌索酸和总三萜酸具有很好的抗炎止咳作用，是枇杷叶抗炎、止咳作用的主要活性成分。枇杷叶三萜酸粗提物对正常小鼠空腹灌胃葡萄糖后的血糖上升有明显的抑制作用，同时对正常小鼠空腹灌胃淀粉后的血糖上升有较强的抑制作用[18]。HuangY[19]等考察枇杷叶三萜酸对慢性支气管炎大鼠肺泡巨噬细胞中诱导型iN-OS表达的影响，发现枇杷叶三萜酸通过抑制NO浓度增加，iNOS表达，以达到治疗慢性支气管炎的作用。LeeCH［20］等对枇杷叶三萜酸对慢性支气管炎大鼠的治疗作用，发现熊果酸不仅能抑制LPS诱导IL－8生成和NFκB活化，还能抑制iN-OS和mＲNA的表达。检测方法2.1乌兰-3有效成分体外检测方法研究中药中有效成分的测定方法多采用高效液相色谱法、薄层扫描法、气相色谱法，毛细管电泳法和分光光度法等。2.1.1茜草有效成分检测王志伟等[21]利用氢核磁共振法来测定茜草中大叶茜草素和羟基茜草素的含量。使被萃取的物质从集体或体系中分离，进入到介电值常数较小，最佳工艺条件下多糖提取率最高为10.2%。杨红帅等[22]利用超声辅助离子液体-反相液相色谱法来测定茜草中茜草素与大叶茜草素素含量。超声波法对茜草的成分进行提取，确定了超声波提取茜草根中茜草素的最佳工艺条件：超声条件45min，乙醇溶剂浓度为75%，用量为20倍。李芙蓉等[23]则采用UFLC法测定茜草中羟基茜草素和大叶茜草素。李丽[24]用HPLC法测定蒙药乌兰三味汤剂中茜草素含量。结果:茜草素在0.008～0.44μg之间成线性关系（r=0.999），回收率为102.6%;不同批次乌兰三味汤剂中茜草素平均含量为0.82mg·g－1。周桂坤等[25]采用RP－HPLC法测定蒙成药乌兰三味汤散中大叶茜草素的含量。大叶茜草素在0.1608～0.8040μg·ml－1范围内线性关系良好（r＝0.9997），平均回收率为：98.7％，RSD＝1.4％。刘娜等[26]采用高效液相色谱法测定蒙药乌兰三味汤散中羟基茜草素和大叶茜草素的含量，结果：羟基茜草素对照品在97.0～970.0ng范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=355197x-33743，r2=1。大叶茜草素对照品在98.3～983.0ng范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=209843x-3827.6，r2=0.9999。根据以上的文献综述得出相关结论，用微型化学实验来提取是适应绿色化学要求而发展起来的一种化学实验新技术，是在微型化的仪器装置中用尽可能少的试剂进行试验。2.1.2枇杷叶有效成分检测严华等[27]和哈及尼沙等[28]采用薄层色谱扫描法检识药材中熊果酸和齐墩果酸，为质量标准的制定提供了新的思路。冯海燕[29]等建立了毛细管电泳法快速测定柿蒂中熊果酸和齐墩果酸的方法。周静等[30]以HP1毛细管柱（25m×0.32mm，0.52μm），柱温280℃，氮气为载气，氢火焰检测器，最终表明能够得到齐墩果酸和熊果酸的良好线性曲线，回收率分别为（100.5±1.9）%，（99.8±2.1）%。闫花丽[34]等以重氮甲烷衍生化气相色谱法进行药材中熊果酸和齐墩果酸的测定。王玮玓[31]等建立了快速测定木瓜中齐墩果酸和熊果酸含量的HPLC－UV方法。该方法可提高齐墩果酸与熊果酸的分离效果，分离度达到2.74。唐策[32]等采用HPLC－PAD法测定藏药翼首草不同药用部位中齐墩果酸和熊果酸含量，并进行方法学考察。廖壹[33]建立了用HPLC－ELSD同时测定泽兰中齐墩果酸与熊果酸含量的方法。杨晓静[35]等建立了一种同时检测中药材中齐墩果酸和熊果酸含量的HPLC－MS/MS方法。结果表明，齐墩果酸和熊果酸的回收率分别为101.1%和100.8%(ＲSD分别为1.80%和0.04%);使用该法对10种不同中药材中齐墩果酸和熊果酸含量进行检测，与已报道方法相比，该方法具有有机溶剂用量少、干扰小、准确度高且超高效分离的特点。王欢等[36]采用HPLC－DAD同时测定了白花蛇舌草中熊果酸和齐墩果酸。戴云等[37]用分光光度法测定了三萜化合物齐墩果酸和熊果酸对DPPH自由基的清除率，并与多酚物质绿原酸和鞣花酸的相应性能进行了比较。结果表明:在齐墩果酸和熊果酸质量浓度为1.0mg/mL时，对DPPH自由基的清除率分别为63.09%和6.02%，二者的抗氧化活性近似，小于2种多酚化合物，但和稠环多酚鞣花酸的接近。2.2乌兰-3有效成分体内检测方法研究2.2.1茜草的体内检测郑作亮[38]利用高效液相色谱-质谱联用技术对茜草醇提液、茜草入血成分、茜草素和羟基茜草素代谢途径进行分析研究。结果在血浆中样品中，检测出11个原型成分和17个代谢产物，多是茜草素和羟基茜草素的代谢产物。司南等[39]采用反相高效液相法测定茜草70%乙醇提取物以及灌胃给药(ig)该提取物一定时间的动物血浆样品。结果：茜草提取物中均能够检测到存在与茜草根中的蒽醌衍生物及大叶茜草素；茜草70%乙醇提取物，经ig给药后，血浆样品中仅能检测到茜草根中的蒽醌衍生物及大叶茜草素，并且给药15min，茜草根中的蒽醌衍生物的血药浓度达到最高，给药后30min，大叶茜草素的血药浓度达到最高。2.2.2枇杷叶的体内检测董林毅[40]分别采用Caco-2单层细胞实验，外翻肠囊实验和肝微粒体酶代谢等研究方法进行研究。结果：枇杷叶中的三萜酸类成分在体内发生水解、脱水、甲基化和氧化等作用进行结构转化，同时熊果酸成分又有大部分经粪便排泄。Jeong等[41]的实验结果说明60%的齐墩果酸在含有还原型辅酶Ⅱ（NADPH）的大鼠肝微粒体中孵化1h后消失，主要被代谢成羟基齐墩果酸和双羟基齐墩果酸。王亚平等[42]采用9种细胞色素P450(CYP)选择性抑制剂和14种人重组CYP单酶分别与熊果酸共孵育，利用高效液相法检测熊果酸及代谢产物的含量，并且测定相关动力学参数Km和Vmax。考察了齐墩果酸在人肝微粒体孵育体系中的代谢稳定性，结果是齐墩果酸在人肝微粒体中不代谢。3.总结3.1全文总结乌兰-3作为蒙医传统名方，现在和将来在治疗多种疾病中会发挥重要作用。所以对其中的有效成分进行研究是很有必要的，选择有效的检测方法同样重要。体外检测的方法主要有这种氢核磁共振法，灵敏度高，得到的信号较多，所以对化合物的纯度要求高；超声辅助离子液体-反相液相色谱法要进行离子液体种类的选择、分散剂的选择等，之后才开始进行高效液相色谱的测定工作；超快速液相色谱（ultrafastliquidchromatog-raphy,UFLC）在略高于普通液相色谱压力极限下即可实现高流速、高分辨率，适用于高通量、高效率的分析；分光光度法灵敏度高，但是准确度不高；高效液相色谱法精密度高，重现性与分离效果好，不需要衍生物，操作简便易行，广泛应用于定量定性分析的各个领域。体内检测方法主要有外翻肠囊法，它操作简便，试验条件易控制，重复性好，但是肠在体外要保持活性，培养温度要与动物体温一致；Caco-2细胞模型相对简单、重复性好，由于其含有各种胃肠道代谢酶，因此更接近药物在人体内吸收的实际环境；肝微粒体模型具有代谢快、易大量操作等优点，肝微粒体法具有制备方便容易、重现性好、酶混合体易保存和孵育条件易优化等优点，但是其缺点对试验结果影响较大，比如在体外孵育体系中容易导致非特异性反应，缺少代谢所需要的完整的酶反应体系，需要加入适量的辅助因子NADPH等。HPLC-MS/MS具有较低的检测限，较快的分析时间，较高的自动化程度，较广的分析范围，较强的分析能力，定性分析结果可靠等优点。并且在体内外的检测中均有应用，在实验中可以做到方法的统一。3.2今后的发展与展望基于以上问题，可以采用液质联用等技术对血液共孵育物进行仪器分析，用统计学方法进行组间比较，结合文献及药效结果，锁定组间差异大且可信度高的色谱峰进行下一步追踪。采用以上研究得到的指标性成分，将给药剂量折合成临床剂量，分设不同剂量组，进行药物代谢动力学的研究，测量这些成分在大鼠体内的口服吸收后转化、代谢情况。该蒙药的药理作用需要阐明，质量标准也需要提高和完善，在临床研究方面，观察病例、给药方法及剂量等多个环节缺乏充足的说服力，空白对照及阳性对照观察方面尚未起步或者不够规范，鉴于上述存在问题，应该加强临床研究，并提倡应用现代分析的方法进行研究，为乌兰-3的进一步开发利用奠定基础。通过上述研究，确定了检测乌兰-3的有效成分的最优方法，HPLC-MS/MS具有较低的检测限，较快的分析时间，较高的自动化程度，较广的分析范围，较强的分析能力，定性分析结果可靠等优点。并且在体内外的检测中均有应用，在实验中可以做到方法的统一。为后续乌兰-3的作用机制和药代动力学等的研究提供了技术参考。参考文献[1]包美荣，陈沙娜，阿拉坦松布尔.过敏性紫癜蒙医辩证论治的体会[J].中国民族医药杂志，2018，24(7):34-35.[2]白领柱，陈沙娜.临床分析蒙、西医治疗120例儿童过敏性紫癜[J].中华继续医学教育，2018，9(11):143-144.[3]国庆，乌兰图雅，陈沙娜.蒙药古日古木-8治疗儿童过敏性紫癜疗效观察[J].中国民族医药杂志，2015，10:15-16.[4]陈沙娜，阿古拉.蒙医药辩证治疗儿童紫癜性肾炎临床疗效分析研究[J].中国民族医药杂志，2016，1：35-36.[5]丰艳花，曹林娟，陈沙娜，乌兰图雅.蒙药治愈儿童紫癜性肾炎的临床体会[J].中国民族医药杂志，2015，4:28-29.[6]月亮，巴日格其.蒙药治疗糖尿病玻璃体出血[J].赤峰学院学报（自然科学版），2015，31(2):91-93.[7]赵长宝，乌日娜，阿拉嘎.蒙医对糖尿病的认识及研究进展[J].中国民族医药杂志，2015，5:68-70.[8]王静.蒙药治疗复发性尿路感染82例疗效观察[J].中国民族医药杂志，2018，24(12):5-6.[9]阿迪亚.蒙药内服外浴治疗寻常型银屑病70例临床观察[J].中国民族医药杂志，2018，24(10):11-12[10]德胜，齐斯琴，萨如拉，娜荷雅，阿拉坦胡乙格，索伦高娃.蒙药治疗布鲁氏菌病的体会[J].中国民族医药杂志，2015(11):26-28，42.[11]卢禁，段宝忠.紫胶中紫胶红色素的化学成分研究[J].沈阳药科大学学报，2022，39(02):134-138.[12]王成虎，李延萍，李群堂等.潜阳封髓丹加减治疗多重耐药菌感染反复发烧3例[J].世界中西医结合杂志，2017，12(03):422-425.[13]ItokawaHetal.ChemBull1984.32(1):284[14]吴彩霞，李辉，石洁，等.三种蒽醌类化合物的抗结核杆菌活性研究[J].医药论坛杂志，2016，37(04):14-15.[15]冯秀香，许兰芝，高尔，等.茜草总蒽醌的解热镇痛作用[J].潍坊医学院学报，2002，24(1)：6-11.[16]侯滔，丁辉，史丽颖，等.羟基茜草素对GPR35受体激动活性的研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2015，17(07):1414-1418.[17]王立为，刘新民，余世春，等．枇杷叶抗炎和止咳作用研究[J].中草药，2004，35(2)：174-176.[18]李锋，王航，薛原楷，等.枇杷叶三萜酸降血糖活性实验研究[J].药物生物技术，2011，18(4)：328-331.[19]HuangY，LiJ，MengXM，etal.Effectoftriterpeneacidsoferiobotryajaponica(thunb.)lindl.Leafandmapksignaltransductionpathwayoninduciblenitricoxidesynthaseexpressioninalveolarmacrophageofchronicbronchitisrats[J].AmJChinMed，2009，37(6):1099-1111.[20]LeeCH，WuSL，ChenJC，etal．Eriobotryajaponicaleafanditstriterpenesinhibitedlipopolysaccharide－inducedcytokinesandinducibleenzymeproductionviathenucle-arfactor－kappabsignalingpathwayinlungepithelialcells［J］.AmJChinMed，2008;36(6):1185-1198.[21]王志伟，闫慧娇，王晓，等.氢核磁共振法测定中药茜草中大叶茜草素和羟基茜草素的含量［J］．山东科学，2017，30(01):1-7.[22]杨红帅，王菊，郭翠，等.超声辅助离子液体-反相液相色谱法同时测定茜草中茜草素和大叶茜草素的含量［J］．中国中药杂志，2015，40(13):2617-2623.[23]李芙蓉，陈世忠，罗世恒，等.UFLC法测定茜草中羟基茜草素和大叶茜草素［J］．中草药，2010，41(12):2087-2089.[24]李丽．HPLC法测定蒙药乌兰三味汤散剂中茜草素含量［J］.中国民族医药杂志，2012，18(06):51-52．[25]周桂坤，莫日根高娃，哈斯高娃，等．RP－HPLC法测定乌兰三味汤散中大叶茜草素的含量［J］.中国药事，2003，17(10):32-34．[26]刘娜，白妍，籍学伟.HPLC法测定蒙药乌兰三味汤散中羟基茜草素和大叶茜草素的含量[J].中国民族医药杂志，2021，17(06):46-48.[27]严华，王宝琹，鲁静．薄层色谱法分离齐墩果酸和熊果酸［J］．药物分析杂志，2009，29(12):2168-2170．[28]哈及尼沙，李改茹，马桂芝．榅桲委陵菜酸、熊果酸和齐墩果酸等三萜酸类薄层色谱分离鉴别［J］．食品安全质量检测学报，2020，11(07):2116-2121．[29]冯海燕，陆敏，杨晓辉，等．毛细管电泳法快速测定柿蒂中的熊果酸和齐墩果酸［J］．化学世界，2013，54(10):601-603+607．[30]周静，刘垣升.气相色谱法测定女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量［J］．中国新药与临床杂志，2003，(10):596-598．[31]王玮玓，吉姆·哈迪，等．以羟丙基－β－环糊精为流动相添加剂测定宣木瓜中齐墩果酸与熊果酸［J］．食品科技，2020，45(04):269-275．[32]唐