第一讲基因工程

第一讲基因工程选修3现代生物科技专题考点一基因工程的操作工具

基因工程，通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。基因工程的概念基因工程的别名操作环境原理基本过程优势目的DNA重组技术或基因拼接技术生物体外基因重组人类需要的生物类型和生物产品定向改造性状、打破物种界限剪切→拼接→导入→检测表达

DNA重组技术的基本工具“分子手术刀”--“分子缝合针”--“分子运输车”--限制性核酸内切酶DNA连接酶载体

DNA重组技术的基本工具识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶化学本质：蛋白质。1、来源：3、作用：4、结果：形成两种末端黏性末端平末端可用于目的基因和载体的切割2、特性：限制酶是一类酶，而不是一种酶。一、限制酶——“分子手术刀”AT磷酸二酯键1234512345

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。平末端

平末端SmaI限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。例1.下列有关基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是(

)

A．一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列

B．限制性内切酶的活性受温度影响

C．限制性内切酶能识别和切割RNA

D．限制性内切酶可从原核生物中提取C1、种类：2、作用部位：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶磷酸二酯键

二、DNA连接酶——“分子缝合针”（黏性末端）（黏性末端和平末端）两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来DNA连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象

作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA连接酶与DNA聚合酶的比较在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸加到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯键1．下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是 (

)

A．①②③④ B．①②④③C．①④②③ D．①④③②C与DNA有关的酶种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子三、载体——“分子运输车”1、载体的作用将

转移到受体细胞中去。目的基因2、常用的载体

质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒3、作为载体必须具备的条件①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；

②有一个至多个限制酶的切割位点,以便于与外源基因连接；

③有特殊的遗传标记基因,供重组DNA的检测和鉴定有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。有切割位点能复制并带着插入的目的基因一起复制质粒——裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。最常用运载体——质粒典例1.下列关于染色体和质粒的叙述，正确的是()A．染色体和质粒的化学本质都是DNAB．染色体和质粒都只存在于原核细胞中C．染色体和质粒都与生物的遗传有关D．染色体和质粒都可作为基因工程的常用载体C能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有重组质粒二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素受体细胞

二、基因工程的基本操作程序编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游编码蛋白质调控遗传信息的表达（调控程序）…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G……T‥………TACACGTGCATCAAT………‥C…启动子终止子一：基因的结构1.原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区启动子终止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.

终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。编码区非编码区非编码区启动子终止子外显子内含子编码蛋白质2.真核细胞的基因结构能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能编码蛋白质的序列叫做内含子内含子：外显子：RNA聚合酶结合位点原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的3.原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码二：基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定1、目的基因主要是______________________编码蛋白质的结构基因2、获取目的基因的常用方法：（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库

基因组文库部分基因文库（cDNA文库）（一）从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库

基因组文库部分基因文库（cDNA文库）提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库1.基因文库的构建方法（1）直接分离法(鸟枪法)某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶（2）反转录法基因组DNA文库cDNA文库2.基因组DNA文库与cDNA文库比较2.基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。③前提条件：_______________________；原料：___________、___________、__________________、________________。②原理：__________聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶模板DNA（二）利用PCR技术扩增目的基因④过程：a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、复性（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子——根据已知的氨基酸序列合成DNA蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成已知核苷酸序列的较小基因可以化学合成，不需要模板。（三）人工合成获取目的基因人工合成(基因序列已知，且比较小)DNA合成仪质粒目的基因限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶表达载体同一种1.基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建——核心限制酶切割位点的选择必须保证目的基因，标记基因的完整性，以便于检测和表达。2.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,RNA聚合酶的结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞①载体与表达载体的区别：与载体相比较,表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键

启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA);

终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)提醒：三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞法目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达（1）农杆菌转化法①特点：

易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：

Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。1、将目的基因导入植物细胞③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物（3）花粉管通道法适用于被子植物①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵

新性状动物2、将目的基因导入动物细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：

用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子3、将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性四、目的基因的检测与鉴定检测①导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法——DNA分子杂交②表达检测转录检测——分子杂交翻译检测——抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定DNA分子杂交15N15N14N14N探针转基因生物的DNA变性变性①首先取出转基因生物的基因组DNA；②将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：过程逆转录法化学合成法从部分基因文库，如cDNA文库中获取从基因组文库中获取人工合成从基因文库中获取方法编码乙的DNA序列起始端无ATG(TAC)，转录出的mRNA无起始密码子模板dNTP(脱氧核苷酸)

三、基因工程的应用抗病

抗逆

生长速度品质药物器官移植

将

基因与

等调控组件重组在一起，通过

等方法，导入哺乳动物的

中，将其送入母体，使其发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁生产所需要的药品，称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。乳腺生物反应器乳腺生物反应器的优点：①产量高；②质量好；③成本低；④易提取。

药物蛋白乳腺蛋白基因的启动子显微注射受精卵1、基因治疗概念：基因治疗

把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。（把特定的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，从而达到治疗疾病的目的）2、实例：

将腺苷酸脱氨酶基因转入取自患者的淋巴细胞中，再将这种淋巴细胞转入患者体内。对严重复合型免疫缺陷症的治疗3、原理病人细胞中既含有缺陷基因，又含有通过基因工程导入的正常基因，在病人体内两种基因都存在且都能表达，正常基因的表达产物掩盖了缺陷基因的表达产物，从而治愈了有基因缺陷的疾病。4、基因治疗的类型体外基因治疗：先从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转移的治病方法。（如将治疗囊性纤维病的正常基因转入患者肺组织）5、基因治疗的发展现状：处于初期的临床试验阶段基因诊断概念用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。四、蛋白质工程的崛起

一、蛋白质工程的崛起的缘由基因工程产物基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的,它们的结构和功能符合特定物种生存的需要,却不一定完全符合人类生产和生活的需要。二、蛋白质工程的基本原理1、蛋白质工程的目标

根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。2、天然蛋白质的合成过程DNA（基因）转录mRNA翻译蛋白质基因→表达（转录和翻译）→形成氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能３、蛋白质工程的基本途径预期的蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）4、蛋白质工程的概