T-SHRH 015-2018 化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验方法

71.100.70C2682Y42上海日用化学品行业协会团体标准T/SHRH

015-2018_________________________________________________________________________________________化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验方法Cosmetics

Method

前言…………… 21.范围………………………… 32.原理………………………… 33.仪器………………………… 34.试剂………………………… 35

实验方法…………………… 36.结果计算…………………… 47.试验有效性验证…………… 48.结果报告…………………… 5 本标准按照GB/T1.1-2009给出规则起草。本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。资）有限公司、广东博溪生物科技有限公司、上海日用化学品行业协会。本标准主要起草人：陈媛祺、陈志涛、范倩文、廖峰、吴建铭、吕智、孙培文、林艺青、周泽琳、万向红、李琼、高宏旗、金坚、陈亦华1．范围抑制酪氨酸酶活性而达到美白效果的水溶性原料的功效评价。2.原理pH6.8475nm处可测值的变化，评估原料对酪氨酸酶活性的抑制作用。3.仪器分析天平：感量

0.1mg；试管：10mL；可调节移液枪：1.00mL；紫外可见分光光度计。4.试剂除有另外说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T

6682规定的一级水。Na2HPO4·2O；一水合柠檬酸；pH6.8

的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液① 0.2mol/L

24·2O：14.33g

溶于

水，用玻棒搅拌至溶解；② 0.1

mol/L

一水合柠檬酸：2.1g

100mL

水，用玻棒搅拌至溶解；③ pH6.8

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：0.2mol/L

Na2HPO4·12H2O

154.5

mL，加入

mol/L

一水合柠檬酸

45.5

mL，配制成

的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；酪氨酸酶，活力≥1000unit/mg

固体；左旋多巴，纯度≥；酪氨酸酶溶液：用

pH6.8

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制，100u/mL左旋多巴溶液：用

pH6.8

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制，1mg/mL阳性对照：曲酸，纯度≥98.5%5.实验方法T-0C-DPPH

0溶剂本底mLmL0.51.5mL0.50.5mL3/1/3/1/阳性对照物用

pH6.8

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释成：1mg/mL、0.2mg/mL、0.04mg/mL、系列浓度梯度用以验证试验系统。受试物处理：受试物用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释为多级浓度样品。参照表

1

10mL

TT0CC0样品的每个受试浓度的样品管（T）需设立

3

支平行管，同时酶反应管（C

3

支平行管。在样品管（TT0）中各加入

1mL

相同浓度的样品溶液，酶反应管（C）和溶剂本底（C0）则分别加入

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。TC

0.5mL

T0C0

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液代替，将样品和酪氨酸酶充分混匀，置

℃水浴槽孵育

分钟。依次在各管中加入

5

中，在

475nm

处测定吸光值。

样品加液要求6.结果计算计算酪氨酸酶抑制率：抑制率（%）（1

-

T

-

T0C

C

0

)

100%…………（1）（1）式中：T—样品管吸光值，即样品与酪氨酸酶反应后溶液吸光值；T0—样品本底吸光值；C—酶反应管吸光值

3

次平均值，即未加样品时酪氨酸酶和多巴反应的吸光值；C0—溶剂本底吸光值。7.试验有效性验证

IC50（达到

抑制效果时对应的样品受试浓度）应在

，则认为试验系统有效。应用拟合公式（

R

应用拟合公式（

R

≥0.9）计算各样品的

IC50，IC50越小代表活性越强。准差（Standard

，SD），

值须≤3%，则认为试验平行性有效。8.

结果报告样品在某一受试浓度下的对酪氨酸酶的抑制率应表述为：抑制率平均值±抑制率间的标准差（SD）。对于样品抑制酪