基因的转移与重组体的筛选和鉴定

关于基因的转移与重组体的筛选和鉴定一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起单酶切、双酶切第一节DNA的体外重组DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的DNA称为重组DNA。第2页,共27页，2024年2月25日，星期天（一）直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1~10%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’二、平末端（bluntend）的连接第3页,共27页，2024年2月25日，星期天（1）同聚加尾法（二）人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾－碱基互补第4页,共27页，2024年2月25日，星期天④缺点：③优点：能把任何片段连接起来操作繁琐；外源片段难以回收；同聚物尾巴影响外源基因表达。非酶切位点第5页,共27页，2024年2月25日，星期天（2）衔接物（linker）连接Linker：用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：（二）人工加尾形成“粘性末端”第6页,共27页，2024年2月25日，星期天（1）多核苷酸激酶处理（2）T4连接酶连接（3）限制性内切酶消化（4）目的片段与载体连接第7页,共27页，2024年2月25日，星期天（二）人工加尾形成“粘性末端”（3）DNA接头（adapter）连接法①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’第8页,共27页，2024年2月25日，星期天接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接②优点：连上后就能用。③缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。④防止自我连接5‘p-GATCCCGG-

GGCC-CCGGGGCCCTAG-p5’第9页,共27页，2024年2月25日，星期天Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-3’

GGCC-p5’BamHIadapterP--P

5’HO-GATCCCGG-GGCC

CCGG-GGCCCTAG-OH5’5’HO-GATCCCGG3’GGCC-OH5’nick缺口nick缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化第10页,共27页，2024年2月25日，星期天三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15～20bp与模板互补；5’端内切酶识别序列＋保护碱基避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。第11页,共27页，2024年2月25日，星期天带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC

PCR产物5’--3’CCTAGGCGC

PCR产物-5’3’-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoRI位点BamHI位点AATTC

PCR产物5’--3’CCTAG

PCR产物-5’3’-GGEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！第12页,共27页，2024年2月25日，星期天AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA三、PCR产物的连接2.与T载体直接连接第13页,共27页，2024年2月25日，星期天第二节重组体导入受体细胞一、重组DNA导入大肠杆菌（一）转化（transformation）大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（三）转染（transfection）受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。（二）转导（transduction）借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。第14页,共27页，2024年2月25日，星期天二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞原生质体转化碱金属离子介导的完整细胞转化PEG1000转化法电击法（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞第15页,共27页，2024年2月25日，星期天1.利用原生质体进行转化

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2

PEG插入外源基因的载体共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法转化转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%第16页,共27页，2024年2月25日，星期天

酵母0.1mol/LLiCl处理感受态2.碱金属离子介导的完整细胞转化插入外源基因的载体40%PEG4000热激涂布选择性平板，筛选转化子

吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍转化率：103个

/

g

DNA；共转化现象极少第17页,共27页，2024年2月25日，星期天4.电击转化（1）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，105个/

gDNA（3）单链转化率高于双链单链含有酵母复制子可转化为双链并复制，无复制子可同源整合到受体菌染色体上缺点：需要特定仪器，成本较高3.PEG1000转化PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化第18页,共27页，2024年2月25日，星期天二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞载体介导的转化（农杆菌介导）DNA直接导入（基因抢法、电击法等）种质系统法（花粉管通道法等）（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞第19页,共27页，2024年2月25日，星期天（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌通过农杆菌侵染植物外植体将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株第20页,共27页，2024年2月25日，星期天在饲养平皿的滤纸上培养2天叶盘法的具体操作第21页,共27页，2024年2月25日，星期天又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。DNA1.2

m钨弹头吸附金属微粒加速，进入受体细胞基因枪装入2.基因枪法（genegun）

外植体制备轰击外植体培养及选择第22页,共27页，2024年2月25日，星期天第23页,共27页，2024年2月25日，星期天具体操作1.DNA微弹的制备2.外植体的制备3.DNA微弹轰击4.外植体的培养第24页,共27页，2024年2月25日，星期天植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液电击处理愈伤组织幼苗分化3.电击法（电穿孔法）选择培养第25页,共