特异性抑制人SIRT1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用的制作方法

特异性抑制人SIRT1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用的制作方法特异性抑制人SIRT1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用的制作方法本发明提供一种特异性抑制人SIRT1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用，该表达载体是根据人SIRT1?的mRNA全序列，应用RNAstructure4.4软件对靶mRNA的序列进行评估得到4条靶核苷酸序列，分别在这4条靶核苷酸序列两端引入相应的接头后得到相对对应的shRNA寡核苷酸序列，将shRNA寡核苷酸序列插入到所述的多克隆位点、连结至慢病毒siRNA载体pFIV-H1/U6-copGFP中。所述的多克隆位点包括BbsI酶切位点，正义及反义链的5’端分别添加了AAAG?及AAAA，与BbsI酶切后形成的粘性末端互补；本发明提供的人SIRT1基因表达的shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，可持续、稳定、特异地抑制人SIRT1基因的表达，可用于科学研究及制备治疗人SIRT1基因表达异常相关疾病的药物。【专利说明】特异性抑制人SIRT1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用【技术领域】[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用。【背景技术】[0002]沉默信息调节因子I(silentinformationregulatorI,SIRT1)是NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶,属于Sirtuin家族,可在哺乳动物中表达主要表达于细胞核,最初定义为NAD依赖的去乙酰化酶家族，可使多种蛋白质的赖氨酸残基发生去乙酰化；是一类进化上高度保守的蛋白质，参与细胞内多种生物学事件的发生，由于SIRTl的作用依赖于NAD+，其作用与机体对氧化和代谢反应有关。研究发现SIRTl在DNA损伤修复、细胞周期控制、抑制细胞凋亡、有机体的能量代谢、线粒体功能保护、抵抗氧化应激和延长细胞寿命方面起着重要作用。因此SIRTl作为不同疾病治疗的靶点，逐渐被人们重视。[0003]但，现有技术中尚无转染效率高，且可长效稳定表达特异抑制人SIRTl基因表达的shRNA表达载体。【发明内容】[0004]本发明提供一种特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用，本发明的SIRTlshRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，可持续、稳定、特异地抑制人SIRTl基因的表达等优点，可作为有力工具应用于制备，治疗人SIRTl基因表达异常相关疾病的药物。·[0005]本发明的技术方案是:特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:至少包括靶向人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列和多克隆位点；多克隆位点包括BbsI酶切位点，在正义及反义链的5’端分别添加了AAAG及AAAA，与BbsI酶切后形成的粘性末端互补；所述的shRNA寡核苷酸序列插入到所述的多克隆位点中连结至pFIV-Hl/U6-copGFP表达载体。[0006]所述的shRNA寡核苷酸序列是根据人SIRTl的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNAstructure4.4软件对祀mRNA的序列进行评估得到4条革巴核苷酸序列，分别在这4条靶核苷酸序列两端引入相应的接头后得到相对对应的shRNA寡核苷酸序列。[0007]所述的第一条靶序列Nol:5’-GCAACTATACCCAGAACATAG-3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列，所述的正义链序列No2为:5’-aaagGCAACTATACCCAGAACATAG-3’，所述的反义链序列No3为:5’-aaaaCTATGTTCTGGGTATAGTTGC-3’。[0008]所述的第二条靶序列No4:5’-GCTGATGAACCGCTTGCTATC_3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列，所述的正义链序列为No5:5’-aaagGCTGATGAACCGCTTGCTATC-3’，所述的反义链序列为N06:5’-aaaaGATAGCAAGCGGTTCATCAGC-3’。[0009]所述的第三条靶序列No7:5’-GCTTGATGGTAATCAGTATCT_3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列，所述的正义链序列No8为:5’-aaagGCTTGATGGTAATCAGTATCT-3’，所述的反义链序列No9为:5’-aaaaAGATACTGATTACCATCAAGC-3’。[0010]所述的第四条靶序列NolO’:5’-GGAGATGATCAAGAGGCAATT_3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列，所述的正义链序列Noll为:5’-aaagGGAGATGATCAAGAGGCAATT-3’，所述的反义链序列Nol2为:5’-aaaaAATTGCCTCTTGATCATCTCC-3’。[0011]所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体在制备治疗SIRTl基因表达异常相关疾病药物中的应用。[0012]所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体在制备治疗SIRTl基因表达异常，瘢痕疾病药物中的应用。[0013]shRNA慢病毒表达载体的构建和鉴定:分别合成正义链盒和反义链，退火后连结至慢病毒siRNA载体pFIV-Hl/U6_copGFP(SystemBiosciences)中，将连接产物转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存并进行PCR鉴定，将初步鉴定结果说明shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液进行测序鉴定;shRNA慢病毒表达载体的抽提:将测序结果证实shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液扩增培养，进行大量抽提重组质粒，得到特异抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体。[0014]病毒包装:将shRNA慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞，转染后24h使用含I%FBS的DMEM对细胞进行换液处理，转染48h后收集细胞上清，4000Xg离心5min，然后使用0.45μm的PVDF膜过滤上清液，冰浴保存，测定病毒滴度。[0015]本发明的优点:鉴于由人免疫缺陷病毒(HIV)改构而来的慢病毒载体潜在的生物安全性问题，本发明选择由猫免疫缺陷病毒(FIV)改构而来的慢病毒载体pFIV-Hl/U6-COpGFP(SystemBiosciences)构建shRNA慢病毒表达载体。本发明通过提供的shRNA寡核苷酸序列插入慢病毒的多克隆位点中，靶向人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列，正义及反义链的5’端分别添加了AAAG及AAAA，与BbsI酶切后形成的粘性末端互补，最终构建的SIRTlshRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，可持续、稳定、特异地抑制人SIRTl基因的表达等优点，可作为有利工具应用于制备，治疗人SIRTl基因表达异常相关疾病的药物。[0016]下面结合附图和实施例对发明进一步说明，但不作为对本发明的限定。【专利附图】【附图说明】[0017]图1为不同shRNA寡核苷酸链序列对人增生性瘢痕成纤维细胞SIRTl基因表达的影响；图2为不同shRNA寡核苷酸链序列对人增生性瘢痕成纤维细胞SIRTl基因蛋白表达的影响；图3为本发明的载体图谱。【具体实施方式】[0018]本发明的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:至少包括靶向人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列和多克隆位点；多克隆位点包括BbsI酶切位点，在正义及反义链的5’端分别添加了AAAG及AAAA，与BbsI酶切后形成的粘性末端互补；所述的shRNA寡核苷酸序列插入到所述的多克隆位点中连结至pFIV-Hl/U6-copGFP表达载体。[0019]所述的ShRNA寡核苷酸序列是根据人SIRTl的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNAstructure4.4软件对IEmRNA的序列进行评估得到4条祀核苷酸序列，分别在这4条靶核苷酸序列两端引入相应的接头后得到相对对应的shRNA寡核苷酸序列。[0020]shRNA慢病毒表达载体的构建和鉴定:分别合成正义链和反义链，退火后，连结至慢病毒siRNA载体pFIV-Hl/U6_copGFP(SystemBiosciences)中，将连接产物转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存并进行PCR鉴定，将初步鉴定结果说明shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液进行测序鉴定;shRNA慢病毒表达载体的抽提:将测序结果证实shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液扩增培养，进行大量抽提重组质粒，得到特异抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体。[0021]病毒包装:将shRNA慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞，转染后24h使用含1%FBS的DMEM对细胞进行换液处理，转染48h后收集细胞上清，4000Xg离心5min,然后使用0.45μm的PVDF膜过滤上清液，冰浴保存，测定病毒滴度。[0022]实施例1:人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列的设计在GenBank查找到SIRTl的mRNA全序列(ΝΜ_012238.4|)经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNAstructure4.4软件对靶mRNA的序列进行评估得到4条靶核苷酸序列，见表1，表1.SIRTl基因的4条特异性siRNA靶核苷酸序列【权利要求】1.特异性抑制人SIRTl基因表达的ShRNA慢病毒表达载体，其特征是:至少包括靶向人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列和多克隆位点；在人SIRTl基因的shRNA靶序列正义及反义链的5’端分别添加了AAAG及AAAA，与多克隆位点BbsI酶切后形成的粘性末端互补；所述的shRNA寡核苷酸序列插入到所述的多克隆位点中连结至pFIV-Hl/U6-COpGFP表达载体。2.根据权利要求1所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:所述的shRNA寡核苷酸序列是根据人SIRTl的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNAstructure4.4软件对祀mRNA的序列进行评估得到4条革巴核苷酸序列，分别在这4条靶核苷酸序列两端引入相应的接头后得到相对对应的shRNA寡核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:所述的第一条靶序列Nol:5’-GCAACTATACCCAGAACATAG-3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列，所述的正义链序列No2为:5’-aaagGCAACTATACCCAGAACATAG-3’，所述的反义链序列No3为:5’-aaaaCTATGTTCTGGGTATAGTTGC-3’。4.根据权利要求2所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:所述的第二条靶序列No4:5’-GCTGATGAACCGCTTGCTATC-3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列，所述的正义链序列为No5:5’-aaagGCTGATGAACCGCTTGCTATC-3’，所述的反义链序列为No6:5’-aaaaGATAGCAAGCGGTTCATCAGC-3’。5.根据权利要求2所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:所述的第三条靶序列No7:5’-GCTTGATGGTAATCAGTATCT-3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列，所述的正义链序列No8为:5’-aaagGCTTGATGGTAATCAGTATCT-3’，所述的反义链序列No9为:5’-aaaaAGATACTGATTACCATCAAGC-3’。6.根据权利要求2所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:所述的第四条靶序列NolO’:5’-GGAGATGATCAAGAGGCAATT-3’，两端引入相应的