酶法测定镁离子含量的方法及镁离子诊断试剂盒的制作方法-2

酶法测定镁离子含量的方法及镁离子诊断试剂盒的制作方法专利名称：酶法测定镁离子含量的方法及镁离子诊断试剂盒的制作方法技术领域：本发明涉及酶法测定血浆、血清等样品中镁离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的镁离子诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。背景技术：目前医学上测定血浆、血清等样品中镁离子含量(简称镁测定)的手段比较多，概括起来有比色法、荧光法、离子色谱法、离子选择性电极法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀释质谱法(ID-MS)等。其中决定性的方法是ID-MS，其次是AAS，这两种方法虽然结果准确，但设备复杂、费用昂贵，不适用于常规实验室和自动分析。比色法是应用最广泛的方法，包括甲基麝香草酚蓝法(MTB)、达旦黄法、邻甲酚酞络合酮法(OCPC)、钙镁试剂法(Calmagite)以及新近报道的2-(8’-羟基喹啉-5’-磺酸-7’-偶氮)-变色酸法(8Q5SAC)。比色法操作简便、费用低，适合常规实验室应用，但存在试剂空白吸光度高、易受胆红素和其它阳离子干扰、试剂稳定性差，以及试剂中含有腐蚀性或毒性成分等缺点。离子选择性电极法(ISE)可以测定生理溶液中镁离子活度，采用中性载体(ETH7025)液膜离子选择电极，测定的准确度较高，但仍存在生理范围内的钙干扰，Ca2+最大干扰达10％。离子色谱法在测定之前需要对样本进行预处理，包括酸化稀释和过滤。Thienpont等使用该方法对五种“国际标准和技术学会”用火焰原子吸收分光光度法的定值血清进行了分析，结果平均偏差仅为0.35％，认为离子色谱法可作为测定镁元素总量的有价值的参考方法。酶法测定血浆、血清等样品中镁离子(主要是Mg2+)的研究近几年非常活跃，取得了较大进展。目前已应用于Mg2+测定的酶学方法有①甘油激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；②甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和过氧化物酶偶联法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；④酶联化学发光法；⑤磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；⑥异柠檬酸脱氢酶法；⑦丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联法。总体上看，采用酶法检测镁离子结果准确、干扰小、适合于自动化分析。但是，应用不同的检测试剂和测试路线，检测的灵敏度、检测结果的准确性会有很大差别，直接影响到该方法的使用与推广，这正是人们在该领域内不断研究、发展和创新的原因所在。由于有着非常好的应用前景，对酶法检测镁离子的研究已经成为该领域内的热点。发明内容本发明的目的是提供一种酶法测定镁离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的镁离子诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪对血浆、血清等样品中镁离子的含量进行快速、准确测定，以便推广使用酶法检测镁离子的方法以及相应的诊断试剂盒，使该领域内检测手段得到进一步丰富和发展。为实现本发明的目的，一种酶法测定镁离子含量的方法，采用以下步骤进行首先，将血浆、血清等需要测定的样品与含有甘油、腺苷三磷酸、甘油激酶、甘油-3-磷酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降幅度，进而测算出样品中镁离子的含量。测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。实现本发明方法的镁离子诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液40～200mmol/l，甘油1～40mmol/l，腺苷三磷酸0.2～20mmol/l，还原型辅酶0.2～0.3mmol/l，甘油激酶1000～50000U/l，甘油-3-磷酸脱氢酶1000～50000U/l，稳定剂/试剂总体积10～80％。也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，以利于消除内、外源物质的污染，比如双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分甘油、腺苷三磷酸、还原型辅酶、甘油-3-磷酸脱氢酶等，可以放在试剂II；试剂II中的甘油激酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源物质的污染，还有利于试剂更稳定与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的甘油、腺苷三磷酸、还原型辅酶等可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的甘油-3-磷酸脱氢酶可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的甘油激酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。上述诊断试剂盒的成分当中，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸(Phosphate)缓冲液”或者“磷酸盐(Phosphate-SodiumChloride，PBS)缓冲液”中的至少一种，但选择范围并不受这些列举所限制。此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。用作稳定剂的物质可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。上述镁离子诊断试剂盒的试剂成分当中，所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NAD+)或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADP+)；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NADH)或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADPH)。研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的镁离子诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液80～120mmol/l，甘油10～20mmol/l，腺苷三磷酸2～8mmol/l，还原型辅酶0.2～0.3mmol/l，甘油激酶10000～30000U/l，甘油-3-磷酸脱氢酶10000～30000U/l，稳定剂/试剂总体积10～50％。本发明应用镁离子激活甘油激酶活性的特点，甘油激酶活性激化的程度与血浆、血清等被测样品中镁离子的含量成正比，在腺苷三磷酸的存在下与甘油反应生成甘油-3-磷酸，再偶联甘油-3-磷酸脱氢酶，将还原型辅酶反应成氧化型辅酶。由于还原型辅酶在340nm有非常明显的吸收峰，而它们对应的氧化型辅酶在340nm没有吸收峰，反应所产生的吸光度的变化与样品中镁离子的含量成正比。因此，在固定时间间隔内测定主波长340nm处吸光度的下降幅度，便能很好地反映出样品中镁离子的含量。本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，通过将还原型辅酶反应成氧化型辅酶，定量反映出被测样品中镁离子的含量，测试结果准确；(2)参与酶偶联反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，主要用于测定人体和其它动物体内镁离子的含量，也可以结合稀释、浓缩等辅助手段来测定其它样品中的镁离子；(6)本发明提供的液态镁离子诊断试剂盒，稳定性好，存在于其中的各种酶的三维空间结构保持完整，很好地保证了应用测试效果。做成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。实施例一(单剂)按以下成分和用量配制血清中镁离子诊断试剂盒双甘氨肽缓冲液80mmol/l，甘油10mmol/l，腺苷三磷酸2mmol/l，thio-NADH0.2mmol/l，甘油激酶10000U/l，甘油-3-磷酸脱氢酶10000U/l，乙二醇50％(占试剂总体积)。在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应(吸光度下降，下同)。加入血清样品和配成的单剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。一共检测读点31次，大约每隔20秒记录一次数据，根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中镁离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。实施例二(双剂)按以下成分和用量配制血清中镁离子诊断试剂盒试剂I——咪唑～盐酸缓冲液100mmol/l，甘油15mmol/l，腺苷三磷酸5mmol/l，NADPH0.25mmol/l，甘油-3-磷酸脱氢酶20000U/l，乙二醇50％(占试剂I总体积)；试剂II——咪唑～盐酸缓冲液100mmol/l，甘油激酶20000U/l，乙二醇50％(占试剂II总体积)。在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为负反应。先加入血清样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中镁离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。实施例三(三剂)按以下成分和用量配制血清中镁离子诊断试剂盒试剂I——三乙醇胺缓冲液120mmol/l，甘油20mmol/l，腺苷三磷酸8mmol/l，thio-NADPH0.3mmol/l，丙二醇20mmol/l；试剂II——三乙醇胺缓冲液120mmol/l，甘油-3-磷酸脱氢酶30000U/l，丙二醇50％(占试剂II总体积)；试剂III——三乙醇胺缓冲液120mmol/l，甘油激酶30000U/l，乙二醇50％(占试剂III总体积)。在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度25℃、反应时间20分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I、试剂II和试剂III的总体积之比为1∶25，试剂I、试剂II和试剂III的用量为8∶1∶1，反应方向为负反应。先加入血清样品和试剂I、试剂II，5分钟之后加入试剂III，它们在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中镁离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。实施例四(双剂优选例)按以下成分和用量配制血磷诊断试剂盒试剂I——Tris-HCl缓冲液100mmol/l，甘油10mmol/l，腺苷三磷酸3mmol/l，NADH0.25mmol/l，硫酸铵20mmol/l；试剂II——Tris-HCl缓冲液100mmol/l，甘油激酶16000U/l，甘油-3-磷酸脱氢酶16000U/l，硫酸铵20mmol/l。在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为负反应。先加入血清样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，发生以下原理性反应检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中镁离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。总之，实验证明采用本发明的测定方法，完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器，测定出血浆、血清等样品中镁离子的含量，测试灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。而且，本发明提供的镁离子诊断试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中的镁离子含量。权利要求1.一种酶法测定镁离子含量的方法，包括以下步骤①将待测样品与含有甘油、腺苷三磷酸、甘油激酶、甘油-3-磷酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降幅度，测算出样品中镁离子的含量。2.根据权利要求1所述的酶法测定镁离子含量的方法，其特征在于待测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500。3.根据权利要求1或2所述的酶法测定镁离子含量的方法，其特征在于反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。4.一种镁离子诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液40～200mmol/l，甘油1～40mmol/l，腺苷三磷酸0.2～20mmol/l，还原型辅酶0.2～0.3mmol/l，甘油激酶1000～50000U/l，甘油-3-磷酸脱氢酶1000～50000U/l，稳定剂/试剂总体积10～80％。5.根据权利要求4所述的镁离子诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液的PH范围是6.0～11.0。6.根据权利要求5所述的镁离子诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸缓冲液”、“三乙醇胺缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液”、“咪唑～盐酸缓冲液”、“双甘氨肽缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸缓冲液”或者“磷酸盐缓冲液”中的至少一种。7.根据权利要求4