发酵染菌及防治

关于发酵染菌及防治目的要求：

了解染菌对发酵工业的危害掌握染菌的检查方法熟悉染菌的途径掌握染菌的防治方法掌握噬菌体污染的防治方法第2页,共52页，2024年2月25日，星期天几个问题：1、染菌2、染菌途径3、染菌检查的方法4、染菌防治的方法第3页,共52页，2024年2月25日，星期天发酵染菌防治的意义：现代发酵利用的是微生物的纯培养技术。要严格无菌操作技术。防止发酵过程中的染菌有着重要的意义：保证产品的质量、收率的稳定。保证发酵生产的有序进行。有利于节约型社会的建立。第4页,共52页，2024年2月25日，星期天第一节发酵异常现象及染菌分析一、发酵的异常现象二、染菌检查三、染菌的原因及分析四、染菌隐患的处理第5页,共52页，2024年2月25日，星期天一、发酵的异常现象（一）种子培养的异常现象（二）发酵的异常现象第6页,共52页，2024年2月25日，星期天（一）种子培养的异常现象1、菌体生长缓慢原因：种子质量差、培养基成分不稳定、培养条件没有控制到位。2、菌丝结团原因：种子、培养条件、培养基。3、代谢不正常原因：培养基不合适、培养环境不良、接种量少、污染杂菌。第7页,共52页，2024年2月25日，星期天（二）发酵的异常现象（p184-185）1、消耗缓慢（菌体生长差）（1）原因：产生菌孢子和种子质量不好、发酵条件差、培养基质量差（灭菌不当）等。（2）措施：补充合适的氮源，或磷酸盐，提高发酵温度。2、pH异常发酵过程中一般pH是有一定规律的。如不符合规律则是发酵异常。（1）原因：培养基原料差、灭菌不彻底、加糖过于集中等。（2）措施：可通过加酸或碱调节。最好加入一些生理酸性或碱性盐或缓冲液来调节。第8页,共52页，2024年2月25日，星期天3、溶氧水平异常（p164）正常发酵过程的溶氧水平是由一定规律的。如果溶氧水平与一般规律不一致即发生了异常变化。（1）原因：染菌。染菌的种类：好氧菌、厌氧菌。菌体代谢异常、某些设备或工艺发生故障或变化。（2）措施：检查无菌空气、管道是否渗漏。搅拌设备是否正常运行等。第9页,共52页，2024年2月25日，星期天4、泡沫过多发酵过程中泡沫的消长是有一定规律的。（1）原因：种子过嫩或过老，致使菌体生长差、代谢速度慢，蛋白质胶体物质多。培养基灭菌温度过高或时间过长，培养基成分受到破坏。（2）措施：接种优质种子、对培养基进行合理灭菌。第10页,共52页，2024年2月25日，星期天5、菌体浓度过高或过低由于温度、氧气、培养基、种子质量、菌体自溶等影响微生物的生长，或感染噬菌体等，导致发酵液中微生物的浓度过高或过低。微生物的浓度过低，发酵液转稀：指发酵尚未进入放罐阶段，发酵液就变稀。（1）原因：感染噬菌体、培养条件不合适。（2）措施：防噬菌体、控制合适培养条件。未知的其它原因：可补充氮源促菌丝生长，或补充碳源也可。微生物的浓度过高，发酵液过浓：（1）原因：氮源过多，菌丝生长快、浓度大，从而降低发酵液中溶解氧的浓度，影响发酵正常进行。（2）措施：补入大量的水。第11页,共52页，2024年2月25日，星期天二、染菌检查（p185-186）在发酵过种中，对杂菌污染的及早发现、及时处理，是免除染菌造成严重损失的重要手段。因此，要求有确切、迅速的方法来检测出污染的杂菌。目前常用的方法：（一）显微镜检查（二）肉汤培养检查法（三）平板划线培养或斜面培养检查法（四）发酵过程的异常现象观察法第12页,共52页，2024年2月25日，星期天（一）显微镜检查

1、细菌用革兰氏染色，必要时进行芽孢染色和鞭毛染色，霉菌、酵母菌可直接观察。第13页,共52页，2024年2月25日，星期天（二）肉汤培养检查法1、方法液体培养基的检查:将需要检查的样品接入经灭菌，并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置37℃和27℃分别培养24h，进行观察，观察肉汤是否浑浊。并取样镜检。无菌空气的检查:将葡萄糖酚红肉汤培养基装在吸气瓶中，灭菌后，37℃培养24h，若培养液未变浑浊，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，把过滤后的空气引入吸气瓶中，培养后，若培养液变混或变黄色，表明空气中仍有杂菌，说明过滤系统有问题。第14页,共52页，2024年2月25日，星期天2、应用（1）空气过滤系统。（2）液体培养基。（3）噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。第15页,共52页，2024年2月25日，星期天（二）平板划线培养或斜面培养检查法１、平板划线培养固体平板置培养箱中37℃，保温24h，检查无菌即可使用。将需要检查的样品在无菌的平板上划线，分别置37℃、27℃培养，以适应嗜中温和低温菌的生长，一般在8h后即可观察。培养后，若出现与生产菌株形态不一的菌落，表明可能被杂菌污染。第16页,共52页，2024年2月25日，星期天２、噬菌体检查——双层平板培养法：底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量，先将灭菌的底层培养基溶后倒平板，凝固后，将上层培养基溶解并保持40℃，加生长菌作为指示菌和待测样品混合后迅速倒在底层平板上，置培养箱保温经12～20h观察有无噬菌斑。第17页,共52页，2024年2月25日，星期天（四）发酵过程的异常现象观察法

（p186）如可从溶解氧、pH值、排气中CO2含量、菌体酶活力等变化来判断。1、溶解氧水平异常变化显示染菌。2、pH异常变化显示染菌。

3、排气中CO2异常变化显示染菌。第18页,共52页，2024年2月25日，星期天谷氨酸正常发酵和异常发酵溶氧水平曲线：第19页,共52页，2024年2月25日，星期天三、发酵染菌的原因（一）发酵染菌率

是指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。发酵染菌批数总染菌率=——————100％总投料批数发酵染菌率是指在发酵罐中发生的染菌率，包括染菌后被挽救不了导致倒罐的批数，但种子罐培养的染菌不接入发酵罐，不导致发酵染菌的另行计算。第20页,共52页，2024年2月25日，星期天（二）染菌原因及分析归纳发酵中染菌的主要原因有以下几方面：无菌空气带菌、设备渗漏、种子带菌、灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善等。但还要具体问题具体分析。可从污染的杂菌种类、污染的时间、污染的程度等方面进行综合分析，才能作出正确的判断，从而采取相应的对策和措施。（p186-188）第21页,共52页，2024年2月25日，星期天1、染菌的杂菌种类分析杂菌不同染菌的原因不同：（p187）杂菌原因耐热的芽孢杆菌养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角球菌、无芽孢杆菌等真菌设备渗漏、无菌操作不当、培养基灭菌不彻底等第22页,共52页，2024年2月25日，星期天2、发酵染菌规模的分析（1）大批发酵罐染菌A发酵前期：种子带菌、连消设备染菌。B发酵中后期：如是同一种菌则是无菌空气出问题。（2）部分发酵罐A发酵前期：种子带菌、连消设备染菌。B发酵后期：中间补料染菌、补料管渗漏。（3）个别发酵罐染菌一般原因是设备渗漏造成的。第23页,共52页，2024年2月25日，星期天3、不同污染阶段分析种子培养阶段染菌：原因：种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、接种操作不当或设备因素。发酵开始阶段染菌：原因：种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、接种操作不当或设备因素，无菌空气等。发酵后期染菌：原因：无菌空气、中间补料、设备渗漏、泡沫顶盖以及操作问题。第24页,共52页，2024年2月25日，星期天四、染菌隐患的处理（p188）严格按操作工艺进行投产前进行整个发酵系统的无菌测试严格工人的管理加强在线检测技术定期对设备维修第25页,共52页，2024年2月25日，星期天第二节染菌对发酵的影响（p189）绝大多数工业发酵，无论是单菌发酵还是混合菌种发酵。都是纯种发酵，除了菌种以外的微生物都被视为杂菌。几乎所有的发酵工业都可能遭受杂菌或噬菌体的污染，甚至由于染菌而造成巨大的经济损失。第26页,共52页，2024年2月25日，星期天染菌对发酵产率、提取收得率、产品质量和三废治理都有很大影响。一般生产不同品种污染不同种类和性质的杂菌、污染时间、途径、程度、培养条件等等，最终产生的后果不同。第27页,共52页，2024年2月25日，星期天染菌对发酵的影响：染菌对不同品种发酵的影响不同感染不同种类和性质的杂菌对发酵的影响不同不同发酵时期染菌对发酵的影响不同染菌程度对发酵的影响不同染菌对产物提取和产品质量的影响发酵染菌也造成三废处理困难和对环境的污染

第28页,共52页，2024年2月25日，星期天不同发酵时期染菌对发酵的影响不同：种子培养期染菌：危害大，如发现染菌后应灭菌后弃去。发酵前期染菌：易使杂菌迅速繁殖，与生产菌争夺营养和氧分。因此，应迅速重新灭菌。发酵中期染菌：将严重干扰生产菌的代谢，影响产物的合成。因此，应做到早发现、快处理。发酵后期染菌：如杂菌量不太多，可继续进行发酵；如污染量大，可提前放罐。此期染菌对不同产物的影响不同：如抗生素、柠檬酸影响不大；而肌苷、肌苷酸、谷氨酸等将影响产物的产量、产物提取和产品质量。第29页,共52页，2024年2月25日，星期天第三节杂菌污染后的挽救和处理

(p190）1、种子罐染菌的处理及时用高压蒸汽直接灭菌后排放。2、发酵罐染菌的处理前期染菌：污染的菌对产生菌的危害大，蒸汽灭菌后放掉；污染的菌对产生菌的危害不大，重新灭菌重新接种；污染的菌少，且生长慢，继续运行，并进行发酵参数的控制。中后期染菌：加杀菌剂；培养温度或控制补料量来控制染菌的生长速度。如产品含量达到一定值可以放罐。3、染菌后设备处理用化学物质处理（如甲醛熏蒸）或彻底清洗，再用蒸汽灭菌（120℃，30min以上）。第30页,共52页，2024年2月25日，星期天第四节染菌的途径及预防措施（p190-198）（一）种子带菌的原因及防治（二）无菌空气带菌及防治（三）设备渗漏或设备、管道存在“死角”造成的染菌及防治（四）培养基灭菌不彻底导致染菌及防治（五）操作问题第31页,共52页，2024年2月25日，星期天（一）种子带菌的原因及防治1、培养基及用具灭菌不彻底2、菌种在移接过程中受污染3、菌种在培养过程或保藏过程中受污染第32页,共52页，2024年2月25日，星期天1、培养基及用具灭菌不彻底原因：菌种培养基及用具灭菌均在杀菌锅中进行，造成灭菌不彻底的原因是灭菌锅内空气排放不完全，造成假压，使灭菌时温度达不到要求。防止方法：灭菌时锅内排气完全。第33页,共52页，2024年2月25日，星期天2、菌种在移接过程中受污染原因：当菌种移接操作不当，或无菌室管理不严，就可能引起污染。防止方法：合理设计无菌室，严格无菌室管理制度，严格无菌操作接种。第34页,共52页，2024年2月25日，星期天3、菌种在培养过程或保藏过程中受污染原因：菌种在培养或保藏过程中，由于外界空气进入，也使杂菌进入而受污染。防止：试管的棉塞应有一定的松紧度，不宜太松且有一定的长度；培养和保藏温度变化不宜太大；每一级种子经检查合格后才能使用。第35页,共52页，2024年2月25日，星期天（二）无菌空气带菌及防治在好氧发酵中通入的无菌空气带菌是发酵污染菌的主要原因之一防止：空气净化流程和设备的设计要合理，过滤介质的选用和装填过滤介质的灭菌和管理等方面都要适用、有效、合理。第36页,共52页，2024年2月25日，星期天（三）设备渗漏或设备、管道存在“死角”造成的染菌及防治1、设备渗漏引起的染菌及防治发酵设备、管道、阀门的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏，从而引起染菌。防治办法：选用优质材料，并经常进行检查。如冷却蛇管的微小渗漏不易被发现，可以压入碱性水，在可疑的地方，用浸湿的酚酞指示剂的白布擦，如有渗漏时白布即显红色。第37页,共52页，2024年2月25日，星期天2、设备、管道存在“死角”造成的染菌及防治“死角”：由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应该达到的局部灭菌部位，从而不能达到彻底灭菌的要求。这些部位即为“死角”。其防治：主要从清洗和灭菌来防治。“死角”可以是设备、管道的某一部位，也可以是培养基或其它物料的某一部分，如发酵罐中可存在许多死角。（1）不锈钢衬里破裂形成“死角”。（2）发酵罐底部培养基的沉积污垢形成“死角”。（4）管道转弯处形成的“死角”。（5）法兰连接不当造成“死角”。第38页,共52页，2024年2月25日，星期天（四）培养基灭菌不彻底导致染菌及防治1、原料性状稀薄的培养基易灭菌彻底；而淀粉质原料特别是有颗粒时易灭菌不彻底或是升温过快或混合不均时，易结块，使中心部位在灭菌时“夹生”，导致在发酵过程中团块散开而染菌。防止措施：淀粉质培养基以实罐灭菌为好，在升温时先搅拌均匀，并加入一定量的a－淀粉酶进行液化，并将原料大颗粒筛去。第39页,共52页，2024年2月25日，星期天2、实罐灭菌时未充分排除罐内空气此种情况造成“假压”使罐顶局部温度达不到灭菌要求，导致灭菌不彻底而污染。防止措施：在实罐灭菌升温时，应打开排气阀门有关相连接管的边阀、压力表接管边阀等，使蒸汽通气达到彻底灭菌。3、培养基连续灭菌时蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而受污染。防止措施：培养基连续灭菌时应严格控制灭菌温度，最好采用自动控制装置。第40页,共52页，2024年2月25日，星期天（五）操作问题在发酵过程中由于操作不当而引起杂菌污染：如移种时或发酵过程，罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。防止措施：科学严密的管理，加强工人技术培训和责任心的教育，提高工人的素质。第41页,共52页，2024年2月25日，星期天第五节噬菌体染菌及防治（p198）（一）噬菌体的污染（二）噬菌体的检查方法（三）噬菌体污染原因及防治措施第42页,共52页，2024年2月25日，星期天（一）噬菌体的污染1、噬菌体的污染在发酵生产中常会遇到噬菌体（bacteriaphage）污染，引起溶菌，并随之出现发酵迟缓或停止发酵等异常现象。尤其是利用细菌或放线菌进行的发酵易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染率非常强，传播蔓延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大的威胁。第43页,共52页，2024年2月25日，星期天2、噬菌体污染的特征（1）发酵液光密度上升缓慢，甚至下降，肉眼可见发酵液逐渐变清。（2）耗糖速度缓慢或停止，产物生成量少，发酵液中残糖高。（3）产生大量泡沫，发酵液呈粘稠状。（4）菌体不规则，甚至出现畸形。第44页,共52页，2024年2月25日，星期天3、噬菌体污染的途径噬菌体的直径约0.1μm，可通过环境污染、设备渗漏或“死角”、空气系统、培养基灭菌不彻底、补料过程及操作失误、菌种带进噬菌体或本身是病原性菌株等途径使发酵染菌。在实际生产中，常由于空气的传播使噬菌体潜入发酵的各个环节，而造成污染。第45页,共52页，2024年2月25日，星期天（二）噬菌体的检查方法

1、双层琼脂平板法（1）双层琼脂平板的制备：上层培养基中加入0.2mL发酵菌种悬液和0.1mL待检发酵液；（2）在发酵菌的适宜温度下培养；（3）检查有无透明的噬菌斑。2、液体培养检查法将培养基、发酵菌种及待检发酵液三者混合，培养后观察培养液是否变清。

第46页,共52页，2024年2月25日，星期天3、斑点试验法先制备好涂布有发酵菌种的平板，再用接种环或无菌吸管取少许发酵液在平板上点种，培养后，观察是否有噬菌斑。

4、玻片快速法

将发酵菌种、发酵液和少量琼