海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测技术规程-地方标准

ICS07.080CCSZ0637CodeofpracticeformonitoringmitochondrialDNAgeneticdiversityofmarineIDB37/T4711—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4监测程序 5监测方案设计 26样品采集、保存与运输 26.1采样地点 26.2采样数量及方法 26.3采样记录 36.4样品保存与运输 37样品检测 37.1方法原理 37.2DNA提取 37.3DNA质量检测 37.4引物选择 37.5DNA扩增 47.6PCR产物回收、纯化与序列测定 48质量控制 49数据分析 410监测报告 4附录A（资料性）样品采集记录 5附录B（资料性）设备与试剂 6B.1仪器设备与耗材 6B.2试剂及其配制 6附录C（资料性）酚-氯仿法提取DNA 7附录D（资料性）琼脂糖凝胶电泳 8附录E（资料性）PCR扩增反应体系 9附录F（资料性）检测记录 10参考文献 DB37/T4711—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省海洋局提出并组织实施。本文件由山东省海洋标准化技术委员会归口。1DB37/T4711—2024海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测技术规程本文件确立了海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测程序，规定了监测方案设计、样品采集、保存与运输、样品检测、质量控制、监测报告等技术要求，描述了数据分析方法。本文件适用于海洋动物资源的遗传多样性监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T12763.6海洋调查规范第6部分：海洋生物调查GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1遗传多样性geneticdiversity种内不同群体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和。4监测程序海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测程序包括监测方案设计、样品采集、保存与运输、样品检测、质量控制、数据分析、监测报告，程序见图1。2DB37/T4711—2024图1监测程序图5监测方案设计明确监测海域、监测周期、监测时间、样品采集、保存和运输、样品检测方法、监测指标、质量控制、数据分析、监测报告等。其中，对调查海域某种野生海洋动物资源的遗传多样性监测，宜每5年~10年开展1次；对人工增殖物种宜每年开展1次。6样品采集、保存与运输6.1采样地点采样地点可根据调查需求选择：a)现场调查采样：按GB/T12763.6规定执行。对海洋底栖动物、潮间带动物进行定点采样，对移动迅速的底栖动物可设地笼诱捕。对游泳能力强的鱼类、甲壳类等进行拖网采样；b)非现场调查采样：从调查海域捕捞作业船、渔港或市场直接采集来自目标海域的新鲜渔获物，采样方法按GB/T18654.2规定执行。6.2采样数量及方法按形态学分类后，每个调查海域应采集同一物种30个以上独立个体作为一批样品；保护动物和珍稀濒危动物难以达到该数量的，可积累该海域一定时期内多次调查采集的不同个体，以实际采集到的个体数为准。根据监测对象不同，可分别选择以下采样方法：a)通常采取海洋动物整体；b)对大型海洋动物实行部分采样，取肌肉组织约0.5g；c)对海洋保护动物、珍稀濒危生物实行非致死性采样：3DB37/T4711—2024.视监测生物的具体情况，无菌操作剪取部分鱼类鳍条组织约0.1g，或用无菌注射器于尾静脉处抽取血液约0.5mL；.贝类无菌取小部分外套膜组织；.蟹类用无菌注射器从第3步足基节关节膜处刺入抽取血淋巴0.1mL。6.3采样记录采集的每批样品分别填写样品采集记录，格式参见附录A。6.4样品保存与运输整体采样的个体应保持完整；部分采样的组织应每个个体独立包装。采样后宜立即冷冻保存，不具备冷冻条件的4℃~10℃冷藏，冷藏时间不宜超过24h。样品运输过程中应保证温度在10℃以下。体积小于1cm3的样品或组织，可量取加入10倍以上体积的乙醇（95%以上）或商品化的样品保存溶液浸泡，常温保存与运输。7样品检测7.1方法原理利用聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）技术、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）测序技术和生物信息学分析技术，对海洋动物线粒体DNA中进化速度最快的部分序列，通常采用线粒体控制区（D-loop）序列，不适用D-loop序列的物种可采用细胞色素b（cytochromeb，Cytb）、细胞色素氧化酶I（CytochromeoxidaseI，COI）基因或其他线粒体基因序列，进行单核苷酸多态性分析，获得群体的遗传多样性数据。7.2DNA提取取海洋动物肌肉或鳍条组织约0.1g，液氮冷冻研磨、组织匀浆或剪碎后，用酚-氯仿法或动物组织DNA提取试剂盒提取总DNA；血液样品用血液DNA提取试剂盒提取总DNA。样品检测所用设备和试剂参见附录B。酚-氯仿法提取DNA的步骤参见附录C；用商品化试剂盒提取DNA，操作步骤按说明书进行。7.3DNA质量检测提取的DNA用洗脱液或灭菌双蒸水溶解，取5μL经1%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA质量，电泳方法参见附录D，或取适量DNA溶液用核酸定量分析仪测定，A260/A280比值为1.8～2.0，DNA浓度不低于50ng/μL。经检测DNA质量良好后，-20℃以下冷冻备用。7.4引物选择7.4.1引物设计与合成引物宜引用已公开发表学术论文或研究报告，或在基因数据库中搜索目标物种的线粒体DNA序列自行设计2对～3对，引物宜符合Tm值50℃~60℃、长度18bp～24bp、G+C含量在40%～60%、PCR产物长度400bp～600bp。引物序列通过DNA序列比对工具与目的序列比对验证，检查校正无误后合成。7.4.2引物筛选4DB37/T4711—2024用合成的引物对样品进行预实验。按每对引物的Tm值设定退火温度，按7.5.2进行PCR。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，选择PCR产物条带单一、清晰、且长度与预期一致的引物，作为该物种的遗传多样性监测引物。7.5DNA扩增7.5.1PCR反应液配方参见附录E。7.5.2PCR反应程序：94℃变性5min；94℃变性30s，X℃退火30s（其中X视不同引物的具体Tm值确定），72℃延伸30s～60s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保温。7.6PCR产物回收、纯化与序列测定对所有样品进行扩增后，PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，选择单一、清晰、且长度与预期一致的条带，回收纯化目的片段后测序，或PCR产物直接双向测序。8质量控制每批PCR应同时做空白、阴性、阳性对照，模板依次为无菌超纯水、近源种总DNA溶液、目标物种总DNA溶液。琼脂糖凝胶电泳时，每排样品中至少要同时加一个合适的DNA分子量梯度标准品。9数据分析对测序结果进行比对、剪切和聚类分析，用最大合成似然法（MaximumCompositeLikelihood，MCL）计算群体间或群体内个体间遗传距离，计算单倍体多样性（样本中随机抽取到两个不同单倍型的频率）、平均核苷酸变异数（所有个体的核苷酸变异数之和与个体数的比值）、核苷酸多样性（平均核苷酸差异数与序列长度的比值）等遗传多样性数据。分析结果格式参见附录F。10监测报告监测报告的内容应包括前言、项目概况、每种生物的监测结果、与历史记录比较变化情况、遗传多样性保护存在的问题及保护建议等。5DB37/T4711—2024样品采集记录海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测采样记录见表A.1。表A.1样品采集记录表6DB37/T4711—2024（资料性）设备与试剂B.1仪器设备与耗材仪器设备与耗材应符合以下要求：a)高压蒸汽灭菌器；b)电子天平：精度大于等于0.001g；c)高速冷冻离心机：转速不低于12000r/min；e)PCR仪；f)水平凝胶电泳系统；g)凝胶成像系统；h)核酸定量分析仪；i)无菌离心管：1.5mL、0.2mL；j)无菌移液器吸头：1000μL、200μL、10μL。B.2试剂及其配制除特别说明外，本文使用试剂均为分析纯试剂，配制试剂用水应为灭菌双蒸水或去离子水。所需试剂及配制方法如下：a)蛋白酶K（20mg/mL）；b)十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）裂解液：CTAB20g溶于1000mLTE缓冲液（Tris-HCl1mol/L，EDTA0.5mol/L，pH=8.0），高压灭菌备用；c)乙醇：75%、95%以上；d)Taq酶；e)脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）；f)PCR缓冲液；g)琼脂糖；h)核酸染料；i)DNA分子量标准；j)6×上样缓冲液；k)Tris饱和酚（pH=8.0）；l)三氯甲烷；m)TBE缓冲液：Tris108g，EDTA-Na27.44g，硼酸55g，加去离子水1000mL。7DB37/T4711—2024（资料性）酚-氯仿法提取DNAC.1在1.5mL塑料离心管中加入研磨或剪碎的样品组织约100mg，加入CTAB溶液600μL、蛋白酶K溶液（20mg/mL）10μL，混匀后55℃水浴3h或37℃水浴过夜，期间颠倒混匀几次，至消化液澄清。C.2加入苯酚-氯仿（1:1）溶液500μL，颠倒混匀1min，12000rpm离心5min，吸取上清液500μL至另一支洁净离心管内。C.3重复B.2操作一次。C.4加入氯仿500μL，颠倒混匀30s，12000rpm离心5min，吸取上清液400μL至另一支洁净离心管内。C.5加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃冷冻过夜。C.612000rpm离心5min，倒掉上清液。C.7加75%乙醇500μL，颠倒清洗，12000rpm离心3min，倒掉上清液。C.8重复B.7操作一次。C.912000rpm瞬时离心，用200μL移液器小心吸出管底残留溶液，注意不要吸走管底沉淀。C.10离心管开口放于洁净的环境中，自然干燥15min～30min。C.11加入100μL灭菌双蒸水充分溶解，备用。8DB37/T4711—2024（资料性）琼脂糖凝胶电泳D.1用1×TBE缓冲液制备1%～1.5%的琼脂糖凝胶，以1:10000（体积比）加入核酸染料。D.2取5μL需要检测的DNA，与1μL6×上样缓冲液混匀，点样。用DNA分子量标准做参照。D.30.5×TBE缓冲液中，100V～120V恒压电泳30min左右。D.4凝胶移入凝胶成像系统，254nm紫外光透射下拍照记录并分析。9DB37/T4711—2024（资料性）PCR扩增反应体系PCR扩增反应体系配方见表E.1.表E.1PCR体系配方表MgCl