猪盖塔病RT-PCR检测技术规范

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国南京出入境检验检疫局，南京农业大学。本标准主要起草人：王凯民、赵晓燕、姜焱、侯玉峰、李正高、郁兵、刘骏、唐泰山、陈国强、周斌、张常印。猪盖塔病RT-PCR检测技术规范中研磨，取上清液，备用。5.1.2猪及其产品的处理用带有抗凝剂的采血管采集待检猪的血液混匀；或将组织样品与用DEPC处理水配置的PBS研磨液按1110比例混合，在冰溶中研磨取上清液，备用。5.2.1取200μL预处理的样品，加入800μLRNA提取液TRIZOL,振荡混匀，室温放置5min。5.2.2加入200μL.三氟甲烷，剧烈振摇15s,室温放置2min~3min后，12000r/min离心15min5.2.3吸上层水相于另一新离心管中，加入0,5ml.异丙醇，充分混匀，-20℃放置15min~30min5.2.4弃去上清液，加75%乙醇1ml,,振据混匀，充分洗涤沉淀.7500r/min离心5min(4℃);弃去上清液，室温自然干燥至管壁上无水珠，溶于10pLDEPC处理水中，-70℃保存备用。5.3RT-PCR反应体系配制采用50pL的反应体系；10×Ome-stepRNAPCRbuffer5pL,MgCl₂(25mmol/L)10yL,dNTPMixture(各10mmol/L)5pl..RNaseInhibitor(40(5U/pL)1μL,AMV-OptimizedTag(5U/pL)1pL,上游引物CAP-1(20pmol/gL)1pL,下游引物CAP-2(20pmol/pL)1pL,模板10pL,加无RNA酶的水至总体积50pL,同时设阴阳性对照。5.4RT-PCR反应的循环程序将PCR管放入PCR热循环仪中，按下列程序进行扩增：50℃30min进行反转录；PCR为：94预变性4min;94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸2.5min,30个循环：72℃延伸10min。从PCR热循环仪中取出之后，-20℃保存。5.5RT-PCR扩增产物的电泳检测RT-PCR扩增结束后，取20pl.扩增产物分别和4pl.加样缓冲液混合后，加入到1.0%琼脂糖凝胶(用含溴化乙健的TAE溶液配制)加样孔中，在凝胶的合适位置加入标准相对分子质量标准。用电泳仪进行电泳，电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm~5V/cm·电泳时间为30min~35min。电泳结束后，将凝胶放在紫外光源下检查，用凝胶成像系统记录图像结果。6结果判定观察记录的图像，阳性对照孔出现820bpDNA条带而阴性对照孔未出现的情况下，实验成立。如果待检样品孔出现820bpDNA条带，则猪盖塔病病毒核酸检测为阳性，对扩增条带进行测序，其结果与附录B中B.2序列比较，进行确认；如果待检样品孔未出现820bpDNA条带，则猪盖塔病病毒核酸检测为阴性。(规范性附录)试剂配制A.1电泳缓冲液TAE的配制(50倍)三羟甲基甲烷碱(Trisbnse)242g冰乙酸57.1mL.0.5mol/L(pH8,0)乙二胺四乙酸(EDTA)100mL.蒸馏水100ml.待上述混合物完全溶解后，加燕馏水至1000mL,置4℃冰箱中备用，如配制2%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍成TAE缓冲液。A.21.0%琼脂糖凝胶板制备取1.0g琼脂糖(电泳纯)加入至50ml.1×TAE缓冲液中，在微波炉中充分溶解后，加入最终浓度为0,5μg/mL.的溴化乙锭，用TAE定容至100mL,冷却至60℃后，例人凝胶板中，