水稻条纹病毒、水稻矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒的检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准水稻条纹病毒、水稻矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒的检测方法Detectionofricestripevirus,rConventionalRT-PCRandr2005-09-30发布2005-09-30发布中，华人民共、和国国家质量监督检验检疫总局水稻条纹病毒、水稻矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒的检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法逆转录-聚合南链式反应reversetranseriptionpolymerasechalnreaction,RT-PCR逆转录-聚合酶链式反应，简称RT-PCR,以提取组织或其他材料中的RNA为模板，采用Oligo(dT)或随机引物，在逆转录酶和适宜的反应条件下，RNA被道转录成cDNA,然后再以cDNA作为模实时荧光PCRreal-timefluoescencePCR,RTF-PCR实时荧光PCR方法是在常规PCR的基础上，在引物对所扩增序列段中，加入一条特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5*-3'外切降活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子游离产生荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。4检测方法4.1方法原理水稻条纹病毒、水稻矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒都是RNA病毒。如果样品材料中提取的总RNA中含有水稻病毒的RNA,可通过逆转录酶将病毒RNA逆转录成cDNA,再通过根据病毒核酸保守序列设计的引物对cDNA进行PCR扩增。分析PCR结果即可明确材料中是否含有病毒核酸成分。采用实时荧光定量PCR,可减少检测过程的污染风险，同时利用荧光杂交探针对所扩增的核酸片段进行验证。4.2试剂和溶液除特别规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规定的一级水。4.2.1TrizolRNA提取试剂或RNA抽提试剂盒。4.2.3三氯甲烷。4.2.4异丙醇。4.2.6无水乙醇。4.2.7无RNase水；经DEPC(焦碳酸二乙脂)处理的双燕水或商品无Rnase水。4.2.9硫酸镁(MgSO)25mmol/L.4.2.11逆转录酶：5U/pL,(反应温度和使用浓度按商品提供的使用要求进行)。4.2.13澳化乙锭；10mg/mL。4.2.14DNA分子量标记；100bp~2000bp。4.2.15琼脂糖。4.2.160.5mol/LEDTA,pH8.0;在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(Na-EDTA·2H₄O),在磁力搅拌器剧烈搅拌，调节pH至8.0,然后加水定容至1000mL,分装后高压灭菌备用。4.2.17TE缓冲液，pH8.0₁量(pH8,0),加水定容至1000mL,分装后高压灭菌备用。4.2.1850×TAE缓冲液：称取242gTris,量取47.1mL冰醋酸，100mL.0.5mol/LEDTA(pH8.0),溶于蒸馏水中，定容至1000mL。分装后高压灭菌备用；34.2.19上样缓冲液；含0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF,30%甘油水溶液。4.2.20RNasin(40U/pL)。4.2.21引物和探针：普通RT-PCR检测病毒的引物见表1,实时荧光RT-PCR检测病毒的引物见表1普通RT-PCR检测的引物RSV1:5'-GTCTTCACTTTCCCATTGGTGARSV2:S'-TCTGGTGTTAAGATGGCTGTGGRDV1;5*-GCAACGACAGCTAGCGTTGTRDV2:5'-GAGGTTGCGTGACGAAGCCRBDVI.S'-GAGCTCTTCTAGTCATCGRBDV2:5'-GTGTCACACCACTCTTCT表2实时荧光RT-PCR检测的引物和探针RSVI:5'-GCTGATGAAGATCCTTGCTGRSVr5'-CCTCGAAGAATTCCTTCACCAA-3’RSVBH;5'-FAM-CACTTCAAAGACAGCAACAGAAGTCAGCGG-BRDVf:5'-TGGTGCGCATACGTGTGTRDVr:S°-TCCTCCACGOCTACCCCTRDVBH;5'-FAM-CGCGGAGGCTGGGTCAACCA-BHQ-3’RBDVf₄5'-GTGACATTTTGGCAACTGTGAGA-3”KBDVr:5*-TTCAGAACGGCTCTTCCATTRHDVBH:S'-FAM-AAGACTTGCCGCTTTCTGGACA-B4.3仪器和材料4.3.2实时荧光PCR仪。4.3.4凝胶分析成像系统。4.3.5冷冻离心机。4.3.6-20℃低温冰箱和—80℃起低温冰箱。4.3.7高压灭菌锅。4.3.8微波炉。4.3.9水浴箱。4.3.10制冰机。4.3.11磁力搅拌器。4.3.14PCR反应管：200pL.,5004.3.15无RNaseEppendorf离心管4.4样品处理所取的样品应及时进行检测或放在低温冰箱中保存。取1g有代表性的植物组织，放入洁净的研钵中，加入液氮后迅速研磨成细粉状。昆虫样品取0.1g～0,5g有代表性的样品用液氮迅速研磨成细4粉状。研磨样品应随即进行RNA提取，否则放入超低温冰箱保存。样品处理和检测操作需在符合SN/T1193要求的实验室内进行。4.5RNA的提取和纯化4.5.1取4,4的研磨物0.1g至1,5mL.Eppendorf离心管中，加入1ml.Trizol,震荡混合，室温放置4.5.2加入0.2mL三氯甲烷，震荡混匀15min(禁用漩涡振荡),室温放置15min。4.5.31.2×10*g,2℃~8℃离心15min。4.5.4将上清液移至另一1.5mL.Eppendorf离心管中，加入等体积(约0.5mL)预冷的异丙醇，室湿放置10min。1.2×10*g,2℃~8℃离心10min。4.5.5小心弈去上清液，加入1mL预冷75%乙醇，来回颠倒洗涤沉淀，8×10²g,2℃~8℃离心4.5.6小心弃去上清液，沉淀室温放置5min～10min自然晾干，重悬于30pL无RNase的水中，轻弹管壁使之溶解。在2h内进行RT-PCR反应。4.6逆转录在25pl.反应体系中，添加以下反应成分至相应浓度：1×RT缓冲液；200μmol/LdNTPs;氯化镁(MgCl₂)1.5mmol/L;逆转录引物采用表1所列的相应下游扩增引物，加至1.5pmol/L。加4pL样品RNA,98℃变性2min后迅速移至冰上骤冷3min,再加入200UM-MLV逆转录酶和0.5pLRNasin(40U/pL);补水至25pL。37℃(不同的逆转录酶产品接所规定的温度条件进行操作),1h,95℃,5min,完成道转录过程。也可采用一步法，在一个反应体系完成逆转录和PCR。检测水稻条纹病毒，水稻矮缩病毒，水稻黑条矮缩病毒的普通RT-PCR反应体系见表3。每个反应体系设置两个平行反应。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。也可采用商业RT-PCR一步法或两步法试剂盒。检测时以含病毒材料或含有病毒目标片段的质粒作为阳性对照，以未含病毒的植物组织RNA作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。RT-PCR缓冲液(含MgCl,3mmol/L)21一一1 4水取4pL.样品提取的总RNA,加上游引物和下游引物(20pmol/L)各0.5pL,加去离子水45pL。95℃变性10min,迅速移至冰上骤冷5min。加人RT-PCRbeads,使其溶解，也可照表3反应体系进行42℃,30min反转录，95℃,10min灭活反转录降。95℃、1min;53℃,1min;72℃,!min;35个循环，72℃延伸10min,进行PCR扩增。4.8PCR产物的琼脂精凝胶电沫检测制备2%的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液(LoadingBuffer)和PCR扩增产物，然后将混有上样缓冲液的PCR扩增产物加入样品孔中，并用100bpLadderDNAMarker作分子量标记，进行电5泳分析。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍摄并记录。4.9实时荧光RT-PCR检测实时荧光RT-PCR反应体系见表4。每个反应体系设置两个平行反应。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整，也可采用商业RT-PCR一步法或两步法试剂盒。以病毒材料或含有病毒目标片段的质粒作为阳性对照，以未含病毒的植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。按表4设定样品和对照，设置实时荧光RT-PCR反应参数，反应条件为：95℃,2min;94℃,10s;52℃,20s;72℃、30s;5个循环；94℃,5s;55℃,31s(收集荧光信号),40个循环。反应完成后，分析反应结果。525mmol/1.522215本一 一一5结果判定及表述5.1结果判定对待测样品进行RT-PCR检测，如果阴性对照和空白对照正确，待测样品出现与阳性对照一致的所测病毒的扩增条带，判定结果为阳性。对阳性样品的PCR产物应进行实时荧光RT-PCR检测或进行序列分析，其结果证实与所检测的水稻病毒一致，则可判定样品中含有所检测的水稻病毒。阳性对照，阴性对照和空白对照正确，且样品无扩增条带，判定结果为阴性，5.1.2实时荧光RT-PCR待测