4.(1)基因工程赋予生物新的遗传特性第二课时课件高二下学期生物浙科版选择性必修3

第四章基因工程第一节基因工程赋予生物新的遗传特性第二课时基因工程的一系列操作可使生物获得新的遗传特性早期治疗糖尿病的胰岛素是从牛或猪的胰脏中提取的，由于其个别的氨基酸序列和人胰岛素不一样，使用后会引发人体内的免疫反应。1982年2月5日，著名学术期刊《科学》发表了科学家运用基因工程技术使大肠杆菌合成人胰岛素的研究成果。此项基因工程技术经过完善，最终实现了大肠杆菌能够在装有培养液的发酵罐中大量生产人胰岛素，再经加工制成药品。通过基因工程获得的人胰岛素不仅价格低廉，而且疗效好，拯救了大批糖尿病患者。资料一：运用转基因大肠杆菌生产人胰岛素思考1：什么是基因工程?

培育转基因大肠杆菌生产人胰岛素一般需要哪些步骤？2.基因工程的基本操作步骤获取目的基因构建重组DNA分子将重组DNA分子导入受体细胞检测目的基因及其表达产物思考1：什么是基因工程?培育转基因大肠杆菌生产人胰岛素一般需要哪些步骤？1.基因工程的概念：

指有意识地把一个人们所需的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术。基因工程的一系列操作可使生物获得新的遗传特性一、获取目的基因如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。人们感兴趣、想研究的基因，主要是指编码蛋白质的基因

目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因、人干扰素基因等。1、目的基因：一、获取目的基因——化学合成法2.获取目的基因的方法（1）化学合成法

蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因（不需要模板）②过程①前提：③方法：2.获取目的基因的方法（1）化学合成法基因组文库部分基因文库（2）从基因文库中获取需已知目的基因全部序列

把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆，基因组中所有DNA序列克隆的总汇称为基因文库。含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。基因文库通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因（不需要模板）一、获取目的基因——从基因文库中获取一、获取目的基因——从基因文库中获取①基因组文库：含有一种生物的全部基因。提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段

将DNA片段与载体连接基因表达载体导入受体菌中储存基因组文库提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA反（逆）转录酶单链互补DNADNA聚合酶双链DNA片段与载体连接基因表达载体导入受体菌中储存cDNA文库②cDNA文库：只包含了一种生物的部分基因。cDNA：双链DNA分子原核生物基因真核生物基因非编码区位置作用主要结构编码区位于基因的两端对基因的表达起调控作用启动子终止子与RNA聚合酶结合，控制转录的开始当RNA聚合酶到达时，释放出RNA产物，转录结束核苷酸序列是连续的，转录出的mRNA可直接作为翻译的模板核苷酸序列是不连续的，分为外显子和内含子，两者均会被转录成mRNA前体，再在核内切去内含子对应部分，加工成为成熟的mRNA。基因结构思考3：真核基因的外显子和内含子均会被转录吗？思考2：据图分析，真核细胞与原核细胞中基因表达特点一样吗？分别是什么？真核基因的外显子和内含子都属于编码区，均会被转录真核细胞是先转录后翻译转录形成的RNA需要经过加工，才可用于翻译原核细胞是边转录边翻译转录形成的RNA，不需要加工，可直接用于翻译基因表达特点启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别

启动子终止子起始密码子终止密码子化学成分位置作用DNA片段mRNA上三个相邻碱基DNA片段mRNA上三个相邻碱基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部分，驱动基因转录出mRNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束一、获取目的基因思考4：cDNA文库中是否含有启动子，终止子，内含子？为什么？思考5：为什么cDNA文库中只含有部分基因？

不同组织细胞或同一组织不同发育阶段cDNA文库相同吗？不含。因为cDNA是由成熟mRNA逆转录合成的不相同，例如胰岛素基因的cDNA只能在胰岛β细胞建立的cDNA文库中找到基因的选择性表达一、获取目的基因2.获取目的基因的方法（1）化学合成法基因组文库cDNA文库（2）从基因文库中获取需已知目的基因全部序列（3）利用PCR技术获取和扩增通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因（不需要模板）一、获取目的基因——利用PCR获取和扩增目的基因PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。思考6：结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？（1）原理：（2）条件：模板：原料：酶：引物：待扩增的DNA分子4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、CDNA聚合酶短的D单链DNA（1）DNA复制时，脱氧核苷酸链的延伸使用的原料只能是dNTP。（2）DNA的合成需要能量，dNTP能提供足够的能量思考7：dNTP作为原料的原因是？模仿体内DNA复制过程（

DNA的半保留复制）一、获取目的基因——利用PCR获取和扩增目的基因视频一、获取目的基因——利用PCR获取和扩增目的基因——PCR的引物引物其实就是引子，是一小段单链DNA（体内DNA复制所用的引物是RNA），是作为DNA复制的起始点，决定PCR扩增产物的特异性和长度。1.概念2.引物的长度其长度常用的是15～30个脱氧核苷酸因为过短则特异性低。过长的引物会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。3.引物的种类PCR扩增时应有两种引物，即分别能与两条模板链配对的两种单链DNA。4.结合位点由于DNA复制只能是5'→3'进行，而DNA的两条单链又是反向平行的。5.设计引物的要求引物是复制时所要合成的新链中的一段，在整个PCR周期都一直存在（体内DNA复制因用的引物是RNA，最后是被DNA聚合酶I切除的）。要考虑长度、G/C碱基对的数目外，还要避免两个引物（特别是3’端）间发生互补，避免引物内部出现二级结构等。6.引物数量要求模板链的3’端（2011·江苏）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（图1），请分别说明理由。①第1组：

；②第2组：

。引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物I’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(2016·天津）采用PCR技术扩增HSA基因。图3中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。（3）过程：（包括多次循环）反应过程：模板DNA双链在高温下（90~95℃）氢键断裂，解旋成2条DNA单链温度降低（50~60℃）后，2个引物分别与各自互补的DNA单链结合分别以两条DNA单链为模板，4种脱氧核苷三磷酸为原料，耐高温的TagDNA聚合酶在适宜的温度（约72℃）下，以引物与模板形成的小段DNA双链区为起点，催化合成一条新的DNA互补链。①变性②退火③延伸一、获取目的基因——利用PCR获取和扩增目的基因——过程思考8：预变性的目的是什么？预变性使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。思考11：PCR扩增的DNA片段大小主要由什么决定？思考:10：PCR技术中DNA双链解旋的原理

与体内DNA复制相同吗？为什么？思考9：为什么PCR酶必需耐受高温在高温(80-90C)下使DNA解链，然后降低温度使引物与变性DNA复性不相同

PCR技术中DNA双链在高温(80-90C)下解旋，体内DNA复制时依靠解旋酶引物（引物的碱基序列特异性）PCR原理视频一、获取目的基因——利用PCR获取和扩增目的基因——过程1.目的基因双链DNA片段在第

次循环后出现。2.第n次循环后共有

个分子。这些分子可以分为3种类型：目的基因双链DNA片段为

个，双链中有1条链长于目的基因的DNA片段为

个，双链均长于目的基因的DNA片段有

个。3.共进行n轮循环，总共消耗引物A的数量

个。第n轮循环后，含有引物A的DNA数量

个。三（2n-2n）2（n-1）22n2n-12n-1目的基因：两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，均为短链，平末端小组讨论常用方法：琼脂糖凝胶电泳原理：核酸是带有负电荷的生物大分子，在电场作用下，向正极移动，核酸分子越大，向正极迁移速率越慢。结果：a.每个条带包含的DNA片段长度是相同的。b.DNA可用荧光或放射性染料对DNA进行标记或用亚甲基蓝将DNA染成蓝色。c.DNAMarker是一组已知长度和含量的标准DNA片段混合物。一、获取目的基因——利用PCR获取和扩增目的基因——PCR产物鉴定利用PCR技术扩增目的基因,其原理与细胞内DNA复制类似，如图所示。图中引物为单链DNA片段,它是子链合成延伸的基础。①从理论上推测,第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为

。②在第

轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。15/16三PCR技术与细胞内DNA复制的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式场所酶引物温度结果联系解旋酶催化DNA在高温下变性解旋主要在细胞核内细胞外解旋酶、DNA聚合酶热稳定TaqDNA聚合酶细胞内温和条件3个温度，需在不同温度下进行合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因(1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板(2)原料：均为四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成RNA、最后切除单链DNA、始终存在思考12：用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；热变性调节温度自动调控温度30②PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理；DNA半保留复制活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定——实验原理①DNA分子具有_____________，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些________会向________________的电极移动，这个过程就是电泳。可解离的基团带电粒子与其所携带电荷相反②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关④凝胶中的DNA分子使用

进行染色，再用

以及蒸馏水

，观察并分析琼脂糖凝胶中DNA条带。琼脂糖凝胶电泳凝胶的浓度亚甲基蓝溶液75%酒精脱色DNA分子的大小构象活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定——DNA片段电泳鉴定的原理材料用具①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定——材料用具10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）2μL20μmol/L的引物A4μL20μmol/L的引物B4μL无菌H2O32μLTaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1μL酵母细胞菌液2μL总体积50μL⑧PCR反应体系的配方⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定——材料用具（1）移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分（2）离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）（3）反应：参照右图的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定——方法步骤——1、PCR扩增（1）配制琼脂糖溶液

根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。（2）制备凝胶①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入胶盒，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定——方法步骤——2、琼脂糖凝胶电泳（3）加样将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（4）电泳盖上电泳槽盖，连接好电极插头后再接通电源。将直流电泳仪设置成80V，开始电泳。25min后关闭电源，停止电泳。注意观察溴酚蓝不要迁移出凝胶。活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定——方法步骤——2、琼脂糖凝胶电泳染色方案1：（1）将凝胶放入培养皿，倒入0.1%亚甲基蓝溶液，没过凝胶5mm，染色8min。轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间，不要留有气泡。染液使用后可回收利用。（2）倒入75%酒精没过凝胶5min，不断晃动培养皿1～1.5min。再倒去酒精。（3）加入冷的蒸馏水进行脱色。当出现清晰的蓝色区带时，倒去蒸馏水终止脱色。此过程中可更换染蓝的蒸馏水。如果凝胶在蒸馏水中浸泡过久，条带颜色会变淡直至无色。染色方案2：

向盛有凝胶的培养皿倒入0.002%亚甲基蓝溶液，没过凝胶5mm。轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间。盖上培养皿盖，4℃冷藏过夜。第二天观察到清晰的蓝色区带时，倒去染液，终止染色。染液可回收利用。活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定——方法步骤——3.染色活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定——方法步骤——4.观察用直尺紧贴凝胶表面测量DNA条带迁移距离，即每个DNA条带中央到加样孔的距离（图4-22)根据已知Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度，推测PCR产物长度。在桌上铺一张白纸，在光下手持盛有凝胶的培养皿距白纸5cm以上，找到较为清晰的条带。蓝色条带即为DNA所在位置(（图4-21)，