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第第页谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)试剂盒说明书谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)试剂盒说明书微量法100T/96S注意:正式测定之前选择23个预期差别大的样本做猜测定。测定意义:GSHPx是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽(GSH)氧化的重要酶之一、GSHPx不但能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应,生成氧化型谷胱甘肽GSSG,从而保护生物膜免受ROS的损害,维持细胞的正常功能;而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的损害和加添机体抗辐射等本领。测定原理:GSHPx催化有机过氧化物氧化GSH,产生GSSG;谷胱甘肽还原酶(GR)催化NADPH还原GSSG,再生GSH,同时NADPH氧化生成NADP+;NADPH在340nm有特征汲取峰,而NADP+没有;通过测定340nm光汲取减少速率来计算GSHPx活性。自备仪器和用品:低温离心机、水浴锅、可调整移液器、酶标仪、96孔板和蒸馏水。试剂构成和配置:试剂一:液体120mL×1瓶,室温保管。试剂二:粉剂×1瓶,4℃保管。试剂三:液体10μL×1支,20℃保管。试剂四:液体200μL×1瓶,4℃保管。粗酶液提取:1.组织:依照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。2.细菌、真菌:依照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波碎裂细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。3.血清等液体:直接测定。GSHPx测定操作:1.酶标仪预热30min,调整波长到340nm。2.混合试剂在25℃或者37℃(哺乳动物)水浴中预热30min。3.混合试剂配制:临用前,在试剂二中加入试剂一20mL,充分震荡溶解后加入全部试剂三,混匀。(当天用完)4.试剂四的稀释:吸取21.5μL试剂四,加入5mL蒸馏水充分混匀,临用前配制,配制好的试剂当天使用。5.测定管:依次在96孔板中加入20μL上清液、160μL预热的混合试剂、20μL稀释后的试剂四,快速混匀后于340nm处测定第30s和第210s的吸光值,分别记为A1和A2、△A测定管=A1—A2、GSHPx活性计算:使用96孔板测定的计算公式如下(1).按蛋白浓度计算GSHPx活力单位定义:肯定温度中,每mg蛋白每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。GSHPx(nmol/min/mgprot)=[△A÷ε÷d×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T=1072×△A÷Cpr(2).按样本质量计算GSHPx活力单位定义:肯定温度中,每g样本每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。GSHPx(nmol/min/g鲜重)=[△A÷ε÷d×V反总×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=1072×△A÷W(3)按细胞数量计算活性单位定义:肯定温度中,每104个细胞每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。GSHPx(nmol/min/104cell)=[△A÷ε÷d×V反总×109]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=1072×△A÷细胞数量(4)按液体体积计算活性单位定义:肯定温度中,每毫升液体每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。GSHPx(nmol/min/mL)=[△A÷ε÷d×V反总×109]÷V样÷T=1072×△Aε:NADPH摩尔消光系数6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V反总:反应体系总体积,200μL=2×104L;106:1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);W:样品质量;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=2×102mL;V样总:提取液体积,1mL;T:反应时间,3min。注意事项:(1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力;(2)混合试剂和底物液须临用前配制,配完后置于冰上,当天使
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