细胞工程专业知识

一、什么是动物克隆？

动物克隆是一个经过核移植过程进行无性繁殖技术。发育早期动物胚胎细胞，或成年动物体细胞，经显微手术移植到去掉细胞核卵母细胞中之后，在适当条件下，能够重新发育成正常胚胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近母体之中，能够发育成为正常动物个体。经过核移植而产生动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是经过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体技术，就叫做动物克隆。细胞工程专业知识第1页核移植技术：所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种一项技术。细胞工程专业知识第2页胚胎克隆：使用核供体细胞假如来自多细胞阶段胚胎，叫做胚胎克隆。体细胞克隆：使用核供体细胞来自动物体，叫做

体细胞克隆。细胞工程专业知识第3页细胞工程专业知识第4页细胞工程专业知识第5页细胞工程专业知识第6页细胞工程专业知识第7页二、两栖类细胞核移植1938年Spemann最先提出将多细胞胚胎每一个细胞核移植到去掉核卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎构想。1952年，Briggs和King沿用Spemann思绪和试验技术，首次取得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植后代．核供体为囊胚期胚胎细胞——试验成功核供体为原肠胚期中胚层和内胚层细胞——试验失败细胞工程专业知识第8页1958年到1962年，英国剑桥大学JohnGurdon和Machineer利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育非洲爪蟾．1970年JohnGurdon以一样方法，用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核试验，蛙卵发育成了蝌蚪。细胞工程专业知识第9页三、鱼类核移植从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鮍鱼为材料，进行鱼类不一样亚科间细胞核移植取得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功效上差异，以及细胞质对细胞核影响．细胞工程专业知识第10页1979年，中国科学院武汉水生物研究所利用鲫鱼做移核试验。他们把鲫鱼囊胚期细胞经过385天59代连续传代培养后，再将此种培养细胞细胞核移植到同种鲫鱼未受精卵中。到1980年4月，他们成功地培育了两尾无性繁殖幼鱼，其中一条发育正常。细胞工程专业知识第11页1989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核未受精卵中，实现了不一样种间核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。细胞工程专业知识第12页四、哺乳类细胞核移植1977年，美国缅因州巴尔港杰克逊试验室用“亚无性繁殖”方式，培育出7只单亲小鼠。细胞工程专业知识第13页将卵细胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后放入加有适量细胞松驰B溶液中。经此番处理卵细胞染色体复制后出现了两个核，将此双核细胞放入正常培养液中培养。卵中双核细胞自动融合，而且细胞开始分裂。将此种胚胎移入母鼠子宫培育。生产出7只单亲小鼠。细胞工程专业知识第14页1981年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊试验室合作，首次对小鼠卵进行移核试验取得成功。他们将囊胚内细胞团细胞核移入去核受精卵中，经培养移核卵发育至囊胚期，再将此胚胎移入同时孕鼠子宫内，最终产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育个体。细胞工程专业知识第15页细胞工程专业知识第16页五、核移植技术普通操作程序

核移植克隆哺乳动物技术操作过程主要包含核受体和核供体处理和制备、核移植、重组胚体外或体内培养、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步骤。细胞工程专业知识第17页1．核受体细胞准备去核卵母细胞经常作为核移植受体细胞。这是因为在卵母细胞细胞质含有某种特定因子，能够使移植核中所含有基因表示程序发生重新排列，使已经分化了细胞重新回到发育过程原点，同受精卵一样开始个体发育过程。卵母细胞起源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟MⅡ卵母细胞。二是从屠宰场搜集卵巢，吸出滤泡中卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。细胞工程专业知识第18页2．核供体细胞准备在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整基因组；其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质作用下，产生细胞分化过程倒转，变得如同刚才受精合子一样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体全过程。

供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供体细胞起源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。

细胞工程专业知识第19页3．细胞核移植

惯用核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。胞质内注射是用一个外径5～8μm注核针吸收供体核后直接注射进卵母细胞胞质内方法。透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。细胞工程专业知识第20页4．激活卵母细胞激活包括原因很多，不论是受精引发卵母细胞激活还是人工激活，都会引发卵母细胞发生一系列反应，这些反应是胚胎发育所必需。其激活原理是经过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”状态。细胞工程专业知识第21页5．重组胚体内或体外培养

经融合和激活重组胚移入中间受体作体内或体外培养，观察重组胚发育率。羊、牛、猪核移植胚常采取体内培养方法取得桑椹胚和囊胚，即羊和牛重组胚用琼脂包埋后移入休情期母羊结扎输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和囊胚。猪核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养7d，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔核移植胚多作体外培养，发育至桑椹胚或囊胚。细胞工程专业知识第22页6．胚胎移植重组克隆胚胎移植受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种不一样、繁殖性能强、体格稍大当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）子宫中，待其发育到产仔。细胞工程专业知识第23页六、核移植技术应用1．制备转基因克隆动物，

进行生物药品生产；2．培育优良畜种，扩大良种种群；3．开展异种动物克隆，拯救濒危动物；4．与干细胞技术结合，开展治疗性克隆5．利用核移植技术，硕士物学基本问题。细胞工程专业知识第24页七、克隆羊与体细胞核移植细胞工程专业知识第25页a.胚胎細胞株,b.胚胎纖維母細胞

c.乳腺上皮細胞,d.PCRmicrosatellite细胞工程专业知识第26页细胞工程专业知识第27页第一步取妊娠期6岁母绵羊（FinnDorset白品种母羊）乳腺细胞作核供体细胞，用饥饿法使其进入休眠状态而使全部基因含有活性。细胞工程专业知识第28页第二步注射促性腺激素，促使母羊（SottishBlackface黑面母绵羊）排卵，28~33小时取其未受精卵，快速去核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS连续5天，使其进入G0期做受体细胞。细胞工程专业知识第29页第三步乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电流作用下，将乳腺细胞融入卵中，形成一个含有新遗传物质卵细胞。细胞工程专业知识第30页第四步新卵细胞植入羊结扎输卵管内，6天后发育为桑椹胚或囊胚（8~16个细胞）。细胞工程专业知识第31页第五步将此早期胚胎移入假孕母羊子宫中，产下多利即为6岁母羊复制品，也为白色。细胞工程专业知识第32页细胞工程专业知识第33页细胞工程专业知识第34页为何是突破性工作：第一，处理了使供体细胞与核受体细胞（去核卵细胞）同时方法。第二，处理了用体细胞做核供体与转基因问题。细胞工程专业知识第35页这一结果主要生物学意义：第一，它证实了一个已经完全分化了动物体细胞依然保持着当初胚胎细胞全部遗传信息，而且经此技术处理后，体细胞恢复了失去全能性形成完整个体。细胞工程专业知识第36页第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体细胞作为供体细胞繁殖克隆羊，即成体母羊复制品。它成功提醒我们能够深入做到，在培育体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术准确地诱发核基因遗传改变或准确地植入目标基因，再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意改变细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。也就是说，我们能够按照人意志去改选、生产物种。细胞工程专业知识第37页第三，在当代生物学领域中，沿有任何一项研究结果能够比经过对基因进行有规律地控制而处理更多问题先例。多利羊诞生及生长表明，利用克隆技术复制哺乳类动物最终技术障碍已被突破，在理论上已成为可能。细胞工程专业知识第38页八、克隆技术存在问题

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